发酵全混合饲料在绵羊体外瘤胃发酵中对纤维降解率、纤维降解菌数量及发酵特性的影响

■王 超 薛树媛 李九月 韩红燕

(1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特010031；2.内蒙古大学省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古呼和浩特010031)

全混合饲料（total mixed ration，TMR）是根据反刍动物不同生理阶段的营养需要量以及饲养目的，按照营养调控技术把青贮、干草等粗饲料切成一定长度，再添加一定比例的精料、各种矿物质、维生素等充分搅拌、混合而加工成的一种营养相对平衡的日粮[1]。TMR饲喂技术始于20世纪60年代，最先在美国、英国和以色列等国家使用，20世纪80年代，在韩国和日本被广泛使用。TMR把粗饲料和精饲料混合后再饲喂，可以有效避免家畜的选择性采食，改善一些原料的适口性；相同的饲料配比，可以维持瘤胃发酵和乳成分的稳定性；TMR 饲料可以提高干物质采食量，促使家畜均衡采食，有效减少瘤胃疾病的发生[2]。TMR 的使用促进了集约化养殖场的进程，是养殖业的一次变革。但是，由于TMR含有较多的可溶性糖分，且为了保证TMR的采食效果，一般在TMR中添加40%～50%的水分，因此，在温度炎热的夏秋季节，非常容易发生腐败变质，产生有毒有害物质，对家畜的健康以及畜产品的安全产生潜在性危险。古本史[3]研究表明，TMR饲料在夏季混合后放置12 h就开始发热，24 h后温度可达到50 ℃，TMR 的发热和变败导致饲料营养成分损失、适口性变差、家畜采食量下降等问题发生。Nishno等[4]、Wang等[5]研究表明：TMR经过发酵处理加工成发酵全混合饲料（fermented total mixed ration，简称FTMR）后，拥有比TMR更长的保存期，在开封后不易发生有氧变败，还可以改善饲料的适口性，而且，TMR在发酵过程中一些营养成分发生改变，可以提高饲料的利用率。周振峰等[6]研究表明：饲喂FTMR可以显著增加奶牛干物质采食量，提高产奶量（7.69%）和标准乳产量（5.20%），并且提高粗脂肪和粗蛋白表观消化率。李林等[7]研究显示，饲喂玉米秸秆生物发酵饲料，平均日增重和粗纤维消化率极显著高于玉米秸秆组，干物质消化率显著高于玉米秸秆组。Cao 等[8]试验显示，FTMR 在体外瘤胃培养中可以提高纤维的降解率。张俊瑜[9]研究表明：FTMR饲料可以提高营养物质瘤胃消失率和有效降解率，而且可以显著提高产奶量、标准乳产量、饲料效率和乳糖含量。在邱玉朗等[10]用FTMR饲喂肉羊的试验中，FTMR组肉羊的平均日增重与料重比优于TMR组，FTMR组的粗纤维消化率显著高于TMR组。FTMR饲料在家畜饲养中发挥着重要的作用，关于FTMR在瘤胃内降解情况，对瘤胃发酵，瘤胃纤维降解菌数量变化等影响的研究不多，本研究旨在进一步说明FTMR在体外培养中对干物质和纤维降解率、瘤胃纤维降解菌数量以及瘤胃发酵特性的影响。

1 材料和方法

1.1 TMR和FTMR

全混合饲粮（TMR）的粗料（意大利黑麦草青贮22%、甜高粱青贮8%、全株玉米青贮7%、甜菜渣颗粒8%）精料比为46∶54。试验用TMR 为置于-20 ℃冰箱中保存的上述TMR；试验用FTMR为塑料袋密封发酵的上述TMR（25～30 ℃环境中贮存30 d）。将TMR和FTMR 样品60 ℃烘干48 h 后粉碎过1.0 mm 筛子，称取1.0 g 加入到120 mL 的小口玻璃培养瓶中，作为体外培养的发酵底物。

1.2 体外培养

按照Mcdougal[11]的方法配制人工唾液，培养前持续通入CO2，直到人工唾液变为粉色。选取装有永久瘤胃瘘管的健康绵羊3 只，每日饲喂2 次（08：00 和19：00），早上饲喂之前采取瘤胃液，用4层纱布过滤后与人工唾液按照1∶2配制成人工瘤胃液，在39 ℃水浴锅中边通入N2边量取50 mL加入装有TMR和FTMR底物的小口培养瓶中，用铝盖封口后置于39 ℃恒温振荡水浴箱中培养。记录6 h和24 h产气量，测定培养液pH和挥发性脂肪酸的含量、发酵残渣的干物质(DM)和中性洗涤纤维(NDF)降解率，以及纤维降解菌数量。TMR和FTMR样品设置6次重复。并利用人工瘤胃液设置3个空白平行样品（用于干物质降解率测定）。

1.3 测定内容

①产气量：利用100 mL 注射器每隔2 h 测量一次样品和空白平行样中气体生成量，记录并将气体抽出，培养结束后样品中产生气体之和减去空白平行样中产生气体之和即为培养生成气体量。

②pH值和挥发性脂肪酸的含量：培养液的pH值用pH 计（PB-10Sartorius）测定。将培养样品和空白样品在4 ℃以4 000 r/min 离心15 min，上清液用5%偏磷酸除去蛋白质，用0.22 μL的滤膜过滤，利用高效液相色谱仪（Agilentl 260，色谱柱为：Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 30 mm×8 mm，检测器：SPDM10AVP，流动相：3 mmol/L高氯酸，流速：0.6 mL/min；柱温50 ℃，检测波长210 nm，进样量5 μL）测定挥发性脂肪酸含量。

③干物质和中性洗涤纤维体外降解率：将②中3个培养管以及空白管中离心所得沉淀物分别用纯化水洗涤3 次后，移入坩埚中60 ℃烘干48 h，称取残渣重量，计算出干物质体外消化率。NDF 含量采用ANKOM A200纤维分析仪测定。

干物质体外降解率计算公式：

DMD（%）=100×（A-B+C）/A

式中：DMD——干物质降解率(%)；

A——待测物降解前干物质质量(g)；

B——待测物降解后干物质质量(g)；

C——空白中沉淀物干物质质量(g)。

中性洗涤纤维体外降解率公式：

DNDF(%)=100×（A×N1-B×N2+C×N3）/C×N1

式中：DNDF——中性洗涤纤维降解率(%)；

A——待测物降解前干物质质量(g)；

N1——待测物降解前干物质中中性洗涤纤维含量(%)；

B——待测物降解后干物质质量(g)；

N2——待测物降解后干物质中中性洗涤纤维含量(%)；

C——空白中沉淀物干物质质量(g)；

N3——空白沉淀物干物质中中性洗涤纤维含量(%)。

④纤维降解菌数量测定：将②中另外3个培养管离心所得沉淀物收集放入50 mL离心管中于-20 ℃冰箱保存，取200 mg冷冻沉淀物，根据试剂盒[天根生化（北京）科技有限公司]说明书提取细菌总DNA，利用荧光定量实时PCR（Real-time PCR）对三种主要纤维降解菌：产琥珀酸拟杆菌（Fibrobacter succinogenes）、黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）和白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）进行定量分析，三种纤维降解菌引物设计如下[12]：

F. succinogenes 引物F: GGTATGGGATGAGCTT⁃GC与R: GCCTGCCCCTGAACTATC；

R. flavefaciens 引物F: ATTGTCCCAGTTCAGATT⁃GC与R:GGCGTCCTCATTGCTGTTAG；

R. albus 引 物F: TCTGTCTTTGGGGACGATAA 与R: AAGTGCAGTTCAGGGTTAA。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行独立样本的T 检验，以P＜0.05 为差异显著，文中数据均以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

TMR和FTMR营养成分和pH如表1所示，除可溶性碳水化合物含量和pH值差异较大外，干物质、有机物、粗蛋白质、中性洗涤纤维和非纤维性碳水化合物含量均相近。

表1 TMR与FTMR中营养成分含量以及pH值（风干基础）

培养6 h后，FTMR组气体生成量极显著低于TMR组（P＜0.01）；乙酸、丙酸以及总的挥发性脂肪酸含量均显著高于TMR组（P＜0.05）；两组的干物质和中性洗涤纤维降解率及培养液pH均无显著差异。培养24 h后，FTMR 组干物质和中性洗涤纤维降解率极显著高于TMR组（P＜0.01）；pH值显著低于TMR组（P＜0.05）；乙酸含量极显著高于TMR组（P＜0.01），丙酸和总挥发性脂肪酸含量显著高于TMR组培养液中含量（P＜0.05）。但两组气体生成量无显著差异（P＞0.05），见表2。

培养6 h 后，FTMR 组未降解培养底物中F. suc⁃cinogenes 和R. albus 的16S rDNA 拷贝数比TMR 组有升高趋势，但差异不显著（P＞0.05）；TMR 组和FTMR组中未检出R. flavefaciens。培养24 h 后，FTMR 组未降解培养底物中F. succinogenes 的16S rDNA 拷贝数比TMR 组有升高趋势，差异不显著（P＞0.05）；FTMR组未降解培养底物中R. albus数量和R. flavefaciens极显著高于TMR组（P＜0.01），见表3。

3 讨论

由于在青贮发酵过程中，可溶性碳水化合物(WSC)被乳酸菌所利用，分解成挥发性脂肪酸和乳酸等，使pH 值降低，抑制其他杂菌的繁殖，从而实现饲草料的长期保存。因此，FTMR 中WSC 含量和pH 值都低于TMR，这符合青贮饲料发酵的规律。饲料产气量的大小反映了饲料可消化性的大小，与饲料中有机物的降解程度呈正比[13]。产气量和体外干物质降解率越高，饲料利用率越高[14]。体外干物质降解率（IVDMD）的大小反映了饲料消化的难易程度。体外发酵产气的底物主要是碳水化合物，产气量的多少与瘤胃微生物对底物的利用程度、微生物的活力以及饲料营养价值的高低都相关。Menke 等[15]研究表明：饲料中有机物的消化率和体外培养的产气量之间存在高度的相关性，即产气量越高，饲料在瘤胃内的发酵程度越高。程鹏辉等[16]研究表明饲草品质越好，产气量越大。本试验中，培养6 h，TMR的产气量极显著高于FTMR 的产气量（P＜0.01），随着培养时间到24 h后，FTMR组的产气量高于TMR组，但差异不显著，因为TMR 中WSC 含量高于FTRM 组，体外培养的前期以WSC的降解为主，产生气体也多，体外培养后期以结构性碳水化合物降解较多，气体生成量也较多。本试验结果与Hatew等[17]、Wang等[18]研究结果一致：当饲粮中富含容易发酵的非结构性碳水化合物时，会有助于其被微生物降解，产生更多的气体。培养24 h 后，FTMR 组的干物质降解率和中性洗涤纤维降解率极显著高于TMR 组，显示出干物质降解率与产气量之间的正相关性。这个结果可能提示TMR经过发酵处理后，可以改善饲料品质，使其在瘤胃中利于降解、有助于提高瘤胃消化率，从而提高饲料消化利用率。

表2 TMR和FTMR在体外瘤胃发酵中气体生成量、干物质和中性洗涤纤维降解率以及挥发性脂肪酸含量

表3 体外瘤胃发酵中不同时间点的TMR和FTMR中纤维降解菌16S rDNA基因拷贝数

瘤胃液pH值可以作为评价瘤胃发酵水平的综合指标，综合反映瘤胃微生物、代谢产物、有机酸产生、吸收、排除及中和状况，主要受唾液、日粮性质、处理方法以及其降解物碱化和缓冲的影响[19]。有研究表明：瘤胃pH值低于6.4，瘤胃微生物活性会受到影响，从而影响瘤胃发酵[20]。卢德勋[21]认为促进纤维素消化的适宜瘤胃液pH 值范围为6.0～6.8，pH 值过低时，纤维分解菌生长就会受到抑制。本试验中，培养24 h后，FTMR 的培养液pH 值显著低于TMR 组(P＜0.05)，但二者都处于瘤胃液pH 值的正常范围，认为对瘤胃微生物活力、数量影响比较小。

挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA），包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸等[22]，是由饲料中碳水化合物降解产生，为反刍动物提供能量，有研究表明反刍动物总能量的70%～80%由VFA 提供[23]。李德勇等[24]研究表明：饲料的消化率越高，其挥发性脂肪酸的产量越高，这与本试验结果一致。李旺[25]研究表明，VFA 的生成受饲料日粮组成、饲料加工处理、瘤胃微生物、瘤胃pH值以及饲喂方式的影响。饲料加工处理手段包括粉碎、切断、氨化、碱化、微生物及酶的预处理。这些方法可以提高反刍动物的采食量，扩大饲料与瘤胃液的接触面积，使瘤胃内被发酵的原料和发酵机会增加，提高VFA的产量。本试验中培养6 h和24 h后，FTMR组中总挥发性脂肪酸的生成量均显著高于TMR组(P＜0.05)，显示出FTMR组瘤胃体外培养中消化率高于TMR组。可能就是因为TMR在发酵过程中，改变了饲料中结构性碳水化合物的结合方式，扩大了饲料与瘤胃液的接触面积，提高了瘤胃内消化率，从而提高了总挥发性脂肪酸生成量。

乙酸是反刍动物脂肪合成的主要前体物质，是乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要原料[22]；丙酸可以异生成葡萄糖，保障家畜的生产性能和泌乳性能。本试验中，培养6 h和24 h，FTMR 组培养液中乙酸和丙酸含量都显著高于TMR 组(P＜0.05)，说明FTMR 在瘤胃发酵中可以产生较多的乙酸和丙酸，示意FTMR饲料可能利于保障家畜的生产性能和泌乳性能。

瘤胃内优势纤维降解菌主要包括产琥珀酸拟杆菌（Fibrobacter succinogenes），黄色瘤胃球菌（Rumino⁃coccus flavefaciens）和白色瘤胃球菌（Ruminococcus al⁃bas）[26]。本试验中，培养6 h后，FTMR处理组中F. suc⁃cinogenes和R. albus的16S rDNA拷贝数比TMR处理组呈升高趋势，差异不显著；培养24 h，FTMR处理组中R.albus和R. flavefaciens的16S rDNA拷贝数比TMR处理组极显著升高(P＜0.01)，F.succinogenes也表现为增高趋势，并且FTMR在瘤胃发酵中可以产生较多的乙酸和丙酸。这可能是因为TMR中可溶性糖分子含量比FTMR中高，瘤胃中的NFC分解菌与纤维分解菌竞争可利用氮进而抑制了后者的生长，表现为TMR中纤维降解菌数量低于FTMR。这与Heldt等[27]、Khalili等[28]的研究结果一致：日粮中添加蔗糖降低了纤维的降解速率和程度。本试验结果显示：FTMR在瘤胃中可促进纤维降解菌数量的提升，从而提高了纤维降解率。

4 结论

经过体外发酵表明，发酵TMR（FTMR）可以提高干物质和中性洗涤纤维降解率，促进发酵，提高了纤维降解菌数量。