八子补肾胶囊对衰老小鼠骨质量的保护作用及其对SIRT6/NF-κB/cathepsin K通路的影响

李蕊 李琳 田怿淼 朱如愿 陈贝贝 张浩 夏兵可 张东伟* 王丽丽

1.北京中医药大学中医学院，北京 100029 2.北京中医药大学中药学院，北京 100029

老年性骨质疏松 (senile osteoporosis，SOP) 是一种随着年龄增加诱发的骨代谢性疾病[1]，其主要病因是骨吸收大于骨形成而诱发的骨强度下降、骨脆性增加和骨质量降低，具有高致残率和高死亡率的特点。流行病学研究发现，在2010年至2016年间，中国30个省自治区 SOP患病率已达36 %[2]。据全国第六次人口普查数据显示，截至2010年，我国高于60周岁的老年人口已达到全国总人口的13.26 %。随着社会人口老龄化趋势加剧，SOP的发病率也逐年增高，已严重影响老年人的生活质量。目前临床上用于治疗SOP的药物主要有双膦酸盐、维生素D和补充钙剂等，然而这些药物可能会带来消化道反应、血管疾病风险增加等不良反应。因此，临床亟需研发更有效和更安全的抗SOP药物。近年来，中药在抗骨质疏松方面的显著疗效已逐渐引起研究者的兴趣，也被临床患者认可和接受[3]。

SIRT6是sirtuin (SIRT1-SIRT7) 家族中的一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶，其通过调节NF-κB介导的炎性微环境对SOP患者发挥骨保护作用[4-5]。Zhang等[6]发现SIRT6敲除小鼠骨吸收作用增强，骨形成作用下降，其骨量明显降低。而SIRT6过表达可以降低NF-κB介导的炎性反应，通过延缓软骨细胞的衰老，进而抑制骨关节炎的发展[7]。此外，随着年龄增长，体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累可导致SIRT6表达下降[8]，进而激活NF-κB/cathepsin K信号通路，从而诱发骨质量的下降。因此，改善体内的氧化应激状态，调节SIRT6的表达，可能是SOP防治的新策略之一。

BZBS是由菟丝子、枸杞子、肉苁蓉等中药组成，具有补肾温阳的功效。中医将SOP纳入“骨痿”、“骨枯”范畴，其病因为精髓不足，肾虚失养[9]。BZBS中菟丝子、蛇床子等可温补肾阳，枸杞子、五味子等滋补肾阴，从而达到补肾健骨的目的，这提示该复方可能具有抗骨质疏松的作用。研究[10]表明，BZBS可以上调去势大鼠雄激素水平，临床上也常被用于治疗腰膝酸软等肾阳虚症状，但其对SOP的骨代谢和骨微结构是否具有调节作用目前尚无相关研究。因此，本研究拟D-gal和NaNO2诱导的衰老小鼠为研究对象，观察BZBS的骨保护作用，以及探讨这种作用的潜在机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要仪器：PerkinElmer Quantum GX-micro-CT小动物活体断层扫描仪(Perkin Elmer公司，美国)；Olympus BX53倒置荧光显微镜(Olympus有限公司，日本)；FLUO star Omega多功能酶标仪(BMG Labtech 公司，德国)；Leica EG 1150 H包埋机、EG1150 C冰冻机、RM 2 255轮转式切片机(Leica Biosystem 有限公司，德国)；博勒飞质构仪CT3(BRROKFIELD公司，美国)；傅里叶红外光谱仪(Perkin Elmer公司，美国)。

1.1.2药物与试剂：BZBS由石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号：130201。D-gal(G0750)和NaNO2(31443)购自美国Sigma-Aldrich公司；骨组织抗原修复液(SBT10013)购自上海舜百生物科技有限公司；总抗氧化能力 (T-AOC)、超氧化物歧化酶 (SOD)、脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽 (GSH) 和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 测定检测试剂盒均购自江苏南京建成生物工程研究所；Sirt6(ab62739)、NF-κB Lys310(ab16502)和cathepsin K(ab19027)抗体购自美国Abcam公司；兔二步法试剂盒和DAB显色液购自中杉金桥生物科技有限公司；苏木精和伊红染液购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3实验动物：SPF级ICR雄性小鼠，体质量(20 ± 2)g，购于斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2017-0002，饲养于北京中医药大学科研实验中心清洁级动物实验室，合格证号：SYXK(京)2017-0038，室温恒温(22 ± 1)℃，相对湿度(50 ± 5) %，光暗循环周期12 h/12 h。实验期间，各组动物自由饮水和摄食，并定期更换垫料和笼具。动物实验方案经北京中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1动物分组及药物处理：ICR雄性小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、维生素E(VE)组和BZBS组，每组10只。根据参考文献[11]的方法：模型组、VE组和BZBS组小鼠腹腔注射D-gal[120 mg/(kg·d)]和NaNO2[90 mg/(kg·d)]，连续注射3个月，以造成衰老模型。正常组腹腔注射等体积的生理盐水。并于造模第25天起，VE组和BZBS组小鼠分别给予VE [100 mg/(kg·d)]和BZBS溶液 [1.4 g/(kg·d)]，对照组和模型组小鼠灌胃给予等体积的0.1 % Tween 80，连续干预65 d。

1.2.2Micro-CT扫描：于给药后第65天，取各组小鼠右侧股骨，剔除附着的肌肉组织，根据文献[12]提供的方法，使用PerkinElmer Quantum GX-micro-CT小动物活体断层扫描仪分析扫描骨骺端上方0.5 cm处，并计算骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(TB.SP)、骨体积分数(BV/TV)、骨表面积组织体积比(BS/TV)以及骨总表面积(Tt.Ar)结构指数。

1.2.3骨生物力学和骨材料检测：参照王丽丽等[13]提供的方法，利用质构仪对右侧股骨进行三点弯曲实验，以测定骨生物力学性能，分析计算出弹性模量、极限载荷以及最大应力等骨生物力学参数。

参照Liu等[14]的方法，利用傅里叶红外光谱分析仪分析上述实验后小鼠的右侧股骨的骨材料特性，并计算各组股骨的胶原成熟度、结晶度、酸性磷酸盐取代和矿物质含量。

1.2.4氧化应激指标测定：腹主动脉取血，静置30 min，3 500 r/min离心 15 min，吸取上层血清，然后按照试剂盒相应的说明书测定T-AOC、SOD、MDA GSH和GSH/GSSG的水平。

1.2.5免疫组织化学(IHC)染色：将股骨石蜡切片常规脱蜡至水，依次用骨组织抗原修复液进行抗原修复，用3 %的过氧化物酶阻断剂室温孵育30 min，然后用10 %的山羊血清封闭30 min，分别滴加SIRT6 (1∶200)、NF-κB (Lys310) (1∶100) 以及cathepsin K (1∶100)，4 ℃孵育过夜。次日滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB避光显色，苏木精复染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。置于显微镜下观察、拍照。每组选取股骨切片中7 个互不重叠的视野，采用Image Pro Plus6.0软件进行分析统计，测定阳性细胞的累计吸光值，即为蛋白阳性表达的强度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 BZBS能抑制衰老小鼠股骨微结构的破坏

Micro-CT结果显示(图1)，与正常组相比，模型组小鼠股骨的Tb.N、Tb.Th、BV/TV、BS/TV、Tt.Ar明显降低(P<0.05)，TB.SP明显升高(P<0.05)，说明D-gal和NaNO2诱导的衰老小鼠骨微结构发生破坏；与模型组相比，VE组和BZBS组的小鼠，其Tb.N、Tb.Th、BV/TV、BS/TV、Tt.Ar显著升高(P<0.05)，TB.SP显著下降(P<0.05)。这说明BZBS能改善D-gal和NaNO2诱导的衰老小鼠的骨微结构，从而提高其骨质量。

图1 八子补肾胶囊对衰老小鼠的骨微结构指标的影响Fig.1 Effect of Bazi Bushen capsules on bone microstructure in aged mice

2.2 BZBS能提高衰老小鼠骨强度和改善骨材料构成

骨生物力学参数检测结果显示(图2)，与正常组相比，模型组小鼠的弹性模量、极限载荷、最大应力明显降低(P<0.05)。与模型组相比，VE组和BZBS组的小鼠，其骨生物力学相关指标显著升高(P<0.05)。这说明BZBS能抑制D-gal和NaNO2诱导的衰老小鼠骨强度下降。

图2 八子补肾胶囊对衰老小鼠的骨强度影响Fig.2 Effect of Bazi Bushen capsules on bone strength in aged mice

各组小鼠的股骨材料成分变化分析结果显示(表1)，与正常组相比，模型组小鼠的胶原成熟度和结晶度明显升高(P<0.05)，矿物质含量和酸性磷酸盐取代明显降低(P<0.05)；与模型组相比，VE组和BZBS组小鼠的胶原成熟度和结晶度降低(P<0.05)，矿物质含量和酸性磷酸盐取代显著升高。这说明BZBS能够通过调节骨材料成分的构成而改善衰老小鼠的骨质量。

表1 八子补肾胶囊对衰老小鼠的骨材料特性的影响Table 1 Effect of Bazi Bushen capsules on the bone material properties in aged mice

2.3 BZBS能改善衰老小鼠股骨的病理微结构

股骨组织HE染色显示(图3)，正常组小鼠骨组织的骨显微结构完整，网状排列整齐。与正常组相比，模型组小鼠骨小梁变细、断裂，结构稍紊乱；与模型组小鼠相比，VE组和BZBS组小鼠的骨组织结构有明显改善，骨小梁增粗，排列相对整齐，但尚未恢复至对照组骨微结构的形态。这说明BZBS能明显改善D-gal和NaNO2诱发的衰老小鼠骨显微结构。

图3 八子补肾胶囊对衰老小鼠的骨组织病理微结构的影响Fig.3 Effect of Bazi Bushen capsules on the microarchitecture of bone tissue in aged mice

2.4 BZBS能促进衰老小鼠体内氧化还原的平衡

各组小鼠血清中氧化应激指标检测结果显示(表2)，与正常组相比，模型组小鼠的MDA水平明显升高(P<0.05)，T-AOC、SOD、GSH和GSH/GSSG明显低于正常组(P<0.05)；与模型组相比，VE和BZBS组小鼠，其体内的MDA水平明显下降(P<0.05)，T-AOC、SOD、GSH和GSH/GSSG 水平明显升高(P<0.05)。这说明BZBS能调节体内的氧化还原平衡，改善衰老小鼠体内氧化应激状态。

表2 八子补肾胶囊对衰老小鼠血清中氧化应激水平的影响Table 2 Effect of Bazi Bushen capsules on serum oxidative stress level in aged mice

2.5 BZBS对衰老小鼠骨组织的影响

BZBS能提高衰老小鼠骨组织中SIRT6表达，抑制NF-κB(Lys310)和cathepsin K的表达。

免疫组化结果显示(图4)，与正常组相比，衰老模型小鼠骨组织中SIRT6的表达明显降低，NF-κB的乙酰化水平和cathepsin K水平明显增高(P<0.05)；与模型组相比，BZBS组小鼠骨组织中SIRT6显著升高(P<0.05)，而乙酰化的NF-κB和cathepsin K的表达明显下降(P<0.05)。这说明BZBS可能通过上调SIRT6，抑制NF-κB和cathepsin K蛋白的表达，进而抑制骨吸收作用，从而提高衰老小鼠的骨质量。

图4 八子补肾胶囊对衰老小鼠骨组织中SIRT6、NF-κB 和cathepsin K蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Bazi Bushen capsules on the expression of SIRT6,NF-κB,and cathepsin K protein in bone tissue of aged

3 讨论

本研究发现，BZBS能明显抑制衰老小鼠骨微结构的破坏和骨强度的下降，改善骨材料构成，提高血清中的T-AOC、SOD和GSH水平，降低MDA水平，进而恢复氧化还原平衡状态，升高SIRT6表达水平，抑制NF-κB/cathepsin K的蛋白表达，从而改善衰老小鼠的骨质量。

BZBS 由菟丝子、枸杞子、五味子、蛇床子、金樱子、覆盆子、韭菜子、川楝子、淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉、地黄、川牛膝、人参、鹿茸、海马等组成。本研究通过micro-CT、HE染色、FTIR和三点弯曲实验检测，发现BZBS对骨量、骨微结构、骨材料特性和骨强度有明显的改善作用。其他团队研究也表明，菟丝子[16]能提高去卵巢大鼠的骨密度，改善骨质疏松症状；枸杞子[17]有改善骨微结构的作用；蛇床子[18]能够调节去卵巢大鼠雌激素分泌从而有一定的防治骨质疏松作用，淫羊藿、巴戟天和地黄均有相关实验证明对骨质疏松模型大鼠有改善骨质量的作用[19-21]。这提示，这些药物可能是BZBS发挥骨保护作用的物质基础。

ROS的积累是衰老相关组织退化的一种潜在机制，年龄相关或者卵巢切除的骨量丢失小鼠体内常表现升高的氧化应激水平[22-23]。本研究发现，BZBS能明显降低MDA水平，升高T-AOC、SOD、GSH/GSSG水平，改善氧化应激状态，提示BZBS具有抗氧化作用。吴石磊[24]研究发现淫羊藿对NOX4介导的ROS有明显的抑制作用，对成骨细胞的增殖活力有明显的保护作用；张秀丽[25]也发现地黄的主要成分梓醇可以提高内源性抗氧化酶活力，降低MDA含量，从而对D-gal诱导的衰老小鼠有保护作用。以上研究结果提示，BZBS对衰老小鼠有骨保护作用，可能与改善体内氧化应激水平有关。

衰老小鼠体内的ROS的积累导致氧化应激，进而激活NF-κB的核转移和乙酰化，以及cathepsin K高表达[26]，导致SOP的发生。本研究结果显示，衰老小鼠骨组织中的SIRT6表达水平下降，NF-κB乙酰化和cathepsin K的表达水平较正常组均明显升高，这说明D-gal和NaNO2诱导的衰老小鼠的骨吸收作用增强。BZBS干预衰老小鼠65 d后，其能明显提高骨组织中SIRT6的水平，抑制NF-κB乙酰化和cathepsin K的表达，从而抑制骨量丢失。陈洋等[27]研究发现淫羊藿苷通过上调SIRT6酶抑制NF-κB蛋白表达而延缓衰老相关病变；王凯[28]研究发现与BZBS组成相似的益肾胶囊可以通过SIRT6抑制NF-κB水平。以上研究结果表明，BZBS可能是通过上调SIRT6，抑制NF-κB/cathepsin K信号通路从而降低骨吸收作用有关。

综上所述，本研究表明BZBS能够明显改善衰老小鼠的骨强度和骨微结构，其发挥抗骨质疏松的作用机制之一可能是通过恢复体内氧化还原平衡，进而上调SIRT6，降低NF-κB乙酰化水平，降低cathepsin K的表达，从而改善骨质量。本研究为BZBS抗骨质疏松的临床应用奠定了实验基础，也为防治SOP提供了新思路。