GYY4137通过提高自噬水平和降低氧化应激来保护老年雌性大鼠骨量流失

陈军平 王德伟 谭伟源 袁小洪 余杰锋

遵义医科大学第五附属(珠海)医院骨二科，广东 珠海 519100

骨质疏松症是一种普遍性的骨骼疾病，其特征是骨骼强度受损，骨骼数量和质量下降，通常导致脆性骨折[1]。随着全球人口的老龄化，骨质疏松症已成为严重的社会和公共卫生问题。目前，根据研究的人群，全世界约有2亿人患有骨质疏松症，其发病率已在所有常见疾病中跃升至第七位，患病率为10 %～58 %。随着经济持续的发展，中国人口正在迅速老龄化[2]，并且由于年龄是骨质疏松症的主要危险因素之一，因此骨质疏松症对公共卫生的威胁在中国变得越来越重要[3]。硫化氢(H2S)是一种无色有毒气体，散发着腐烂鸡蛋的恶臭，是调节各种生理或病理细胞功能的重要气体递质[4]。近年来的研究表明H2S对骨量的维持有重要作用[5-7]。GYY4137(一种H2S)可以通过调节钙通道中Ca2+内流来控制干细胞的功能，而GYY4137的缺乏损害了干细胞的成骨分化[5]。最近的研究表明，GYY4137保护成骨细胞免受H2O2或糖皮质激素诱导的细胞损伤[8]。然而，其对老年骨量流失的影响尚不清楚，需要进一步研究。本研究的目的是观察GYY4137对年龄引起的骨量流失的作用及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组和治疗

3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠10只，体重230～250 g作为对照组(Con)及24月龄雌性Sprague-Dawley大鼠20只，体重487～532 g购于上海实验动物中心。大鼠饲养在室温(23±2)℃，12/12 h光暗循环，喂食标准大鼠饲料和水。老年大鼠随机分为模型组(Mod，n=10)和治疗组(Tre，n=10)。所有大鼠适应性饲养1周后，Tre组给予100 μg/kg的剂量腹腔注射GYY4137 (GYY4137购自Santa Cruz Biotechonology，SC-224013)并用0.9 %生理盐水稀释)，每2天1次，治疗12周，在治疗结束，在禁食12 h后对大鼠实施安乐死。

1.2 生化检测

在治疗结束通过颈椎脱位处死大鼠。处死后从下腔静脉抽血，加入抗凝剂后，以3 000 r/min的速度离心20 min以提取血浆。将提取的血浆储存在-70 ℃备用。采用MDA (μmol/mL),GSH (μmol/mL)和SOD (U/L)试剂盒(南京建城，中国南京)按厂家说明书评价血清氧化应激活性。采用ROS ELISA试剂盒(中国上海联硕生物科技)检测血清ROS (U/mL)水平。

1.3 组织学和影像学检查

治疗结束处死大鼠后取下右侧股骨，使用高分辨率Micro-CT扫描系统(GE Locus SP)以标准分辨率模式扫描股骨远端。从生长板远端0.2 mm开始的中心区域的15 mm2区域进行骨测量，以评估骨质量、密度和小梁的微结构。兴趣量(VOI，29 μm*29 μm*29 μm)使用半自动轮廓法选择。生成一系列平面横向灰度值图像。所有图像都用于重建三维图像。使用Micro-CT系统中的软件来计算VOI内的参数：骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

在Micro-CT扫描后，清除附着的结缔组织后，将股骨浸入梯度酒精(70 %、95 %和100 %乙醇，每种情况下3 d)以进行组织脱水。将骨样品包埋在含有甲基丙烯酸甲酯的树脂中。用装备有碳化钨制成的刀片(型号RM2255；Leica Nussloch，德国)的半自动旋转切片机对树脂包埋的样品进行纵向切片。用Goldner三色染色剂对厚度为7 μm的骨切片进行染色，并在光学显微镜下(日蚀Ni-U型；尼康)使用OsteoMeasure系统(版本4.10；OsteoMetrics，乔治亚州亚特兰大)进行分析。

1.4 蛋白印迹(WB)分析

使用细胞裂解试剂盒(Beyotime，Jangsu，China)提取股骨远端总蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜与特异性抗体孵育，并使用ECL检测试剂盒(Beyotime，江苏 中国)进行检测。使用Image Lab Version 2.1(Bio-Rad)软件通过密度分析量化蛋白质表达。

1.5 统计学处理

采用Mann-WhitneyU检验比较各组大鼠血清各指标。用Friedman分析评价各组指标的变化。采用Wilcoxon秩和检验对各组参数进行分析。采用卡方检验比较各组的组织学参数。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化应激指标比较

与Con组相比，Mod组大鼠血清丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平明显升高，谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)明显降低；Tre组大鼠血清MDA和ROS水平明显降低，GSH和SOD水平明显升高，组间差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与Con组相比，*P<0.05;与Mod组相比，#P<0.05。图1 各组大鼠血清氧化应激指标水平Fig.1 Serum oxidative stress index levels in each group of rats

2.2 组织学分析

股骨干骺端骨小梁结构如图2所示，Con组大鼠股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁网状结构正常。Mod组大鼠骨小梁变薄，导致骨小梁间隙变宽。Tre组大鼠骨小梁数量和连接增加明显，骨小梁结构大都恢复。

图2 三组股骨的组织病理学(10*)Fig.2 Histopathology of the femurs in the three groups(10*)

2.3 Micro-CT检测结果

每组中的大鼠股骨干骺端微结构如图3 A所示，股骨干骺端的微观参数如图3 B～F所示。Mod组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Con组明显降低，而Tb.Sp则明显升高(P<0.05)。Tre组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于Mod组(P<0.05)，而Tb.Sp则明显低于Mod组(P<0.05)。

2.4 蛋白印迹结果

治疗12周后，三组股骨均进行Atg 5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62蛋白表达检测，结果显示Tre组Atg 5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1的蛋白表达明显高于Mod组(P<0.0 5)，而p62显著低于Mod组(P<0.0 5)，见图4。

注：与Con组相比，*P<0.05；与Mod组相比，**P<0.05。图3 三组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果Fig.3 Results of micro-CT in the femoral metaphysis in the three groups of rats

注：与Con组相比，*P<0.05；与Mod组相比，**P<0.05。图4 WB分析示Atg 5、PLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62的蛋白表达Fig.4 Protein expressions of Atg 5，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin1,and p62 analyzed with Western blotting

3 讨论

本研究使用年龄诱导骨量流失大鼠作为研究模型，通过GYY4137治疗12周后，检测大鼠骨量和氧化应激指标丙二醛和超氧化物歧化酶、髓过氧化物酶和活性氧水平改变；同时检测股骨远端自噬状态的重要标志蛋白的表达情况；结果表明在GYY4137治疗12周后，大鼠股骨骨密度及骨小梁微观参数显著改善；同时发现大鼠的氧化应激水平下降以及自噬水平降低；本研究表明GYY4137可能通过影响自噬水平和氧化应激状态来改善老年大鼠的骨量和骨密度。

氧化应激，由于过度产生活性氧损害细胞成份，研究认为氧化应激在骨质疏松发生发展过程中起到重要的作用[9]。本研究中老年大鼠体内的氧化应激指标丙二醛和髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶在GYY4137治疗后出现显著降低；表明治疗后老年大鼠体内氧化应激水平降低。自噬是一种重要的细胞应激反应机制，除了细胞凋亡外，自噬是一种细胞保护机制，也是细胞程序性死亡的另一种方式。先前的研究[10]表明，骨细胞中存在自噬，当骨细胞在体外受到缺氧或糖皮质激素的干预时时，自噬起到了保护作用。目前，研究普遍认为活性氧物种诱导自噬[11]，而自噬在几种病理条件下起到减少氧化损伤的作用[12]。抗氧化剂的减少可能与多种原因有关；E2缺乏症，清除自由基的能力下降，白介素6和肿瘤坏死因子α升高[13]。Melville等[14]首先报道骨细胞自噬，通过清除氧自由基对氧化应激具有保护作用[12]。在成骨细胞特异性雌激素受体基因敲除小鼠中观察到成骨细胞自噬水平升高。本研究的发现与早期报道一致，H2S产量降低可能会增强骨骼中氧化应激的作用[8]。

GYY4137是一种缓慢释放的H2S供体，已被广泛用于研究H2S在生物过程中的作用[8]。我们使用GYY4137治疗来预防年龄引起的骨质流失。GYY4137可以恢复了游离H2S的水平，并通过经典Wnt信号通路、Erk信号通路防止了股骨干骺端骨小梁丢失和骨密度降低[5-7]。与该发现一致的是，本研究表明老年大鼠骨细胞的自噬增加。本研究表明老年大鼠骨骼中Atg5、LC3和Beclin1蛋白质水平在H2S治疗后明显降低，而p62的水平明显增加。这些数据表明自噬可能是骨量流失条件下对急性炎症和应激的反应机制。此外，本研究自噬水平下降而抗氧化生物标志物(髓过氧化物酶活性)出现提高。本研究结果表明自噬对氧化应激具有保护作用，这与多项研究[14]一致。抗氧化作用的可能机制是自噬可以去除氧化的蛋白质，活性氧和受损的线粒体[15]。此外，我们的研究表明GYY4137治疗后出现自噬水平降低，而骨量和BMD出现升高。这些发现与以前的研究表明自噬与骨远端骨密度显著相关一致[16]。在本研究中，由于老年大鼠体内雌激素显著降低，导致骨组织中抗氧化生物标志物的减少和自噬水平的提高，而GYY4137处理可以部分逆转这种作用。这表明是自噬不仅受雌激素的调节，还受其他细胞因子、氧自由基等的调节。

考虑到自噬与氧化应激状态、骨质流失的关系，GYY4137治疗后出现骨量增加，表明GYY4137是骨代谢的潜在候选者，GYY4137可以通过改善自噬和氧化应激水平来预防年龄引起的骨质流失，后期会进一步探索可能的机制。