TSK凝胶色谱系统测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中的高分子杂质

王桂英 张红梅 魏永涛 许爱华 崔 震 张守忠

(1.济南市食品药品检验检测中心，济南 250102；2.山东省计量科学研究院，济南 250014)

注射用阿莫西林钠克拉维酸钾为阿莫西林钠与克拉维酸钾按标示量之比5∶1均匀混合制成的无菌粉末，目前已广泛用于临床，主要治疗由产酶耐药菌引起的呼吸及泌尿系统的感染。作为β-内酰胺类抗生素，过敏反应是其在临床上不容忽视的问题[1，2]，文献研究表明，药物中存在的高分子杂质是引发各种速发型过敏反应的过敏原[3，4]，因此，控制该类制剂中的高分子杂质含量具有重要意义。注射用阿莫西林钠克拉维酸钾国内现行有效的质量标准是《中国药典》2015年版二部，但未将高分子杂质纳入质量标准。本试验参考相关文献[5-7]，建立了注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中高分子杂质的测定方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪( 美国安捷伦仪器有限公司)；赛多利斯ME5 BT125D电子天平[d=0.01mg]；阿莫西林对照品(批号130409-201512，含量86.9%)；克拉维酸对照品(批号130429-201708，含量95.1%)；乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相为0.005 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.0)-乙腈(80:20)。色谱柱为TSK GEL 2500 PWXL(300 mm*7.8 mm,5 μm)，检测波长254 nm，柱温：25 ℃，进样量20 μL，流速：0.5 mL·min-1。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取供试品适量，加水溶解并稀释制成含阿莫西林1.0 mg·mL-1的溶液。0.45 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取阿莫西林对照品适量,精密称定,加流动相溶解并稀释制成含阿莫西林10 μg·mL-1的溶液,作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

2.4 强制降解试验

精密称取注射用阿莫西林钠克拉维酸钾适量，按“2.2”项下方法配制成含阿莫西林钠1.0 mg·mL-1的溶液，分别进行强酸(加0.1 mol·L-1盐酸溶液1 mL，室温放置5 min)、强碱(加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，室温放置5 min)、强光(4500 lx，6 h)、高温(65 ℃水浴加热10 min)、氧化(加入1%双氧水2 mL，放置5 min)等强制降解试验，得各降解试验溶液。精密量取上述各降解溶液各20 μL，分别注入色谱仪，记录色谱图。结果供试品经破坏后，高分子杂质均有增加，其中经氧化破坏后高分子杂质增加尤为明显。结果表明，高分子杂质峰与主峰有效分离，本色谱系统专属性良好。结果见图1、图2。

图1 典型色谱图A.供试液；B.阿莫西林对照品；C.克拉维酸对照品；D.溶剂

图2 破坏降解试验色谱图A.强酸降解；B.强碱降解；C.强光降解；D.高温降解；E.氧化降解；F.双氧水溶剂

2.5 线性

精密称取阿莫西林对照品，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释制成3.84、9.59、19.19、47.97、95.94 μg·mL-1系列浓度的对照品溶液。精密称取克拉维酸对照品，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释制成4.04、10.11、20.22、50.54、101.09 μg·mL-1系列浓度的对照品溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。分别以阿莫西林钠、克拉维酸钾浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得阿莫西林回归方程为y=6.02668x-0.165586(相关系数r=1.0000)，克拉维酸回归方程为y=1.19874x+0.501622(相关系数r=0.99998)。结果表明，阿莫西林在3.84～95.94 μg·mL-1、克拉维酸在4.04～101.09 μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.6 检出限与定量限

分别将阿莫西林、克拉维酸对照品溶液逐级稀释，记录色谱图，阿莫西林检出限为0.24 μg·mL-1，定量限为0.80 μg·mL-1；克拉维酸检出限为1.35 μg·mL-1，定量限为4.50 μg·mL-1。

2.7 精密度和重复性

精密吸取阿莫西林钠对照品(9.59 μg·mL-1)、克拉维酸钾对照品(10.11μg·mL-1)各20μL，按“2.1”色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，峰面积的RSD分别为0.25%和0.47%，表明仪器精密度良好。

平行制备供试品溶液6份，按“2.1”色谱条件进样分析，测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中高分子杂质的总量，平均结果为1.75%，RSD=0.8%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性

取供试品溶液，按“2.1”色谱条件，分别于 0、0.5、1、2、3 h 时进样，计算得RSD=8.4%(n=5)，说明供试品不稳定，提示应临用新制。

精密称取克拉维酸钾原料0.02 g，用水溶解配制浓度为含克拉维酸200 μg·mL-1的溶液，按“2.1”色谱条件，分别于 0、1、2、3、5 h时进样，峰面积无显著变化，说明克拉维酸钾溶液5 h内基本稳定，对样品高分子杂质的检测结果计算无影响，故本实验高分子杂质的结果按外标法以阿莫西林计算。

2.9 样品测定结果

3家企业9批注射用阿莫西林钠克拉维酸钾，按“2.1”项下的方法进行测定，用外标法按阿莫西林计算高分子杂质的含量。结果见表1。高分子杂质含量平均值为1.46%。

表1 注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中高分子杂质含量情况

3 讨论

3.1 磷酸盐缓冲液浓度的选择

流动相中磷酸盐缓冲液的浓度最初考虑0.005、0.01、0.05 mol·L-13个方案，试验发现浓度为0.005 mol·L-1时，主峰与相邻杂质峰已能较好的分离，综合考虑，选择浓度较低的磷酸盐缓冲液作为流动相。

3.2 耐用性试验

通过改变波长±2nm、柱温±5℃、pH±0.2来考察分析方法的耐用性，实验结果表明，在波长、柱温、pH等条件发生微小变化时，两主峰与相邻杂质峰均能良好分离，说明本方法耐用性较好。

3.3 结论

本试验建立了一种检测注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中高分子杂质的TSK凝胶色谱法，并对方法进行了评价，试验表明该方法操作简便，灵敏度高，重现性好，为LC-MS鉴别注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中的高分子杂质分析奠定了基础，也为制剂的质量研究提供参考。