绵羊种布鲁菌致病机制与防控研究进展

周志雄，顾国婧，李文杰，李博文，赵 宇，罗艺晨，帅学宏，黄庆洲，焦寒伟

(西南大学 动物科学学院 医学研究院免疫学研究中心 兽医科学工程研究中心,重庆 荣昌402460 )

绵羊种布鲁菌病是一种由绵羊种布鲁菌(Brucellaovis,B.ovis)引起的以绵羊流产和繁殖障碍为特征的慢性传染病，主要损害绵羊生殖系统，给绵羊养殖业带来了巨大的经济损失。绵羊种布鲁菌是布鲁菌属中的一种，于20世纪50年代初被发现[1]。它的出现给我国的养羊业造成极大的危害，且绵羊的抗病育种一直成为国内外动物领域专家广泛关注的问题，而且目前绵羊种布鲁菌的胞内寄生机制和感染机制尚不清楚。因此，现将从病原学、流行病学、致病机制、免疫逃避和疾病防控等方面对绵羊种布鲁菌病的研究进展进行概述，为后期挖掘绵羊种布鲁菌的致病机理和与其相关的研究奠定一定的理论基础。

1 病原学

绵羊种布鲁菌病的病原为绵羊种布鲁菌，属于革兰阴性细菌，形态呈球形或短杆形。菌株在初代次分离培养时需要5%～10% CO2，对营养要求较高，在脱纤维羊血固体培养上生长良好，在普通培养基上则生长较差[2]。绵羊种布鲁菌外膜由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、外膜蛋白和磷脂层组成。LPS由3个区域组成，包括脂质A(lipid A)、核心多糖和O抗原[3]，是绵羊种布鲁菌重要的毒力因子，也是介导动物机体产生免疫的重要抗原。1980年，刘志文等[4]发现公羊附睾炎病例，并从患病公羊的精液中分离出绵羊种布鲁菌O19株。

2 流行病学

绵羊种布鲁菌主要感染绵羊，对其他动物基本上没有传染性。张高轩等[5]研究发现，绵羊种布鲁菌新疆地方分离株能够感染恒河猴，说明对人有潜在的感染可能性，该研究与绵羊种布鲁菌不感染人的国际普遍看法存在分歧。此外，有大多数研究表明布鲁菌的发病率与当地气候密切相关，DADAR 等[6]研究发现高气温地区与没有或很少有霜冻日的地区，布鲁菌病的发病率明显降低。CAO等[7]研究发现布鲁菌发病率呈明显的周期性和季节性特征，每年3-7月份为发病高峰期，冬季为发病低谷期。

3 绵羊种布鲁菌致病机制

3.1 绵羊种布鲁菌的致病特点绵羊种布鲁菌入侵动物机体后，在短时间内到达入侵组织附近的淋巴结，被动物机体内的巨噬细胞发现并将其吞噬，被巨噬细胞吞噬后的细菌在巨噬细胞内生长繁殖形成原发病灶，但不表现临床特征[8]。当细菌大量增殖后破坏巨噬细胞，从胞内冲出进入全身血液循环，机体表现出明显的菌血症。当巨噬细胞的吞噬能力不足以吞噬释放出的细菌时，动物机体表现出明显的毒血症或败血症。细菌在动物机体绒毛膜上皮细胞内增殖时，引发胎盘炎。细菌在绒毛膜与子宫黏膜之间出现扩散时，会引起雌性动物子宫内膜炎[9]。妊娠动物受到感染时，细菌在动物绒毛膜上皮细胞内增殖，引起绒毛膜发生坏死并有纤维素性脓性分泌物产生，导致胎盘分离，致使胎儿营养物质缺乏，最终出现流产。

绵羊种布鲁菌通过呼吸道、消化道和皮肤黏膜等途径入侵机体淋巴系统，导致机体免疫功能受阻，机体不能及时清除病原体，在动物机体各脏器内繁殖扩增并引起毒血症导致产生各种病理变化[10]。绵羊种布鲁菌侵入绵羊体内可引起肺脏的布鲁菌性结节[11]。布鲁菌病可能与溶血性并发症有关，包括血栓形成性微血管病和溶血性贫血[12]。布鲁菌感染的巨噬细胞激发并受炎症环境影响的活化T细胞促进破骨细胞的产生，导致骨丢失[13]。

3.2 绵羊种布鲁菌的胞内寄生布鲁菌通过抑制宿主细胞的凋亡，来促进自身在细胞内的生存和增殖复制[14]。在未被免疫的动物中，布鲁菌可以躲避巨噬细胞的吞噬活动，并在巨噬细胞内大量增殖[15]。布鲁菌的感染性主要体现在，病原菌能够在宿主体内和极端的环境条件下，长时间内保持毒力不发生改变，因此这一致病特性对疾病的传播起着关键的作用。

绵羊种布鲁菌具有入侵吞噬细胞[16-17]和非吞噬细胞的能力，并能在其中大量增殖和存活[18-19]。绵羊种布鲁菌在细胞内的存活能力与其自身毒力相关，它主要的毒力因子包括一个由VIRB编码的Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,T4SS)和LPS[16]。有病原学研究表明，布鲁菌外膜蛋白和T4SS家族蛋白与布鲁菌的侵染、胞内寄生和繁殖有着密不可分的关系。T4SS的存在是绵羊种布鲁菌毒力持久性存在的关键[16]。T4SS的功能是使绵羊种布鲁菌株逃避溶酶体的降解作用，进而与内质网相结合。T4SS作为绵羊种布鲁菌重要的毒力因子，并不是最初定植所必需的，但它对于感染的持续性存在是至关重要的。T4SS不仅对绵羊种布鲁菌的细胞内寄生起着重要的作用，对它在细胞外存活也同样起着关键作用[20]。有研究表明，与绵羊种布鲁菌胞内寄生和增殖有关的除了T4SS外，还有EDCBA编码的ABC转运蛋白[21-24]，目前对于ABC转运蛋白的大量研究还在继续。

布鲁菌依靠病原体与宿主细胞之间的分子相互作用的机制侵入宿主巨噬细胞内，形成一种布鲁菌胞内吞噬小体(Brucella-containing vacuoles,BCV)[25]。布鲁菌由于受到宿主细胞内环境和营养物质的局限，自身表达出的一种未知分子与宿主细胞内一种尚未明确的分子发生相互作用，导致BCV内部及其膜表面的分子类型随着感染时间的变化也发生着规律性的变化，而此类变化促进了BCV躲避与溶酶体的结合，而最终到达内质网形成复制小体并长期寄居于此。在此过程中宿主动物的免疫系统很难识别出胞内寄生的布鲁菌是否免疫逃避[26]。此外，随着内质网(endoplasmic reticulum,ER)中复制小体的增殖，布鲁菌的自身部分成分能和宿主细胞发生相互作用，而这种相互作用能抑制宿主细胞合成杀菌物质，影响信号传递通路的启动，诱导超强的变态反应，最终则引起疾病的发生。

布鲁菌通过在细胞内隐藏而不中断细胞生命周期，在很大程度上设法逃避宿主的免疫反应，因此，布鲁菌繁殖可以持续很长时间，导致一种复发形式的无明显疾病期的疾病。有研究结果发现布鲁菌在明显健康的个体中，经过多年的疾病观察和成功的治疗后，实时荧光定量PCR检测相关基因表达显示宿主体内的病原菌并没有被彻底根除[27]。更为重要的是，BCV的酸性环境是抗生素的中和剂，因此，大环内酯类药物通常对布鲁菌病不起作用。此外，公认的体外和体内具有活性的抗生素对布鲁菌可能表现为细胞内活性减弱，需要长期联合用药，单一用药对治疗布鲁菌病是没有效果的[28]。当缩短布鲁菌病治疗方案的持续时间后，有统计学研究表明布鲁菌病可能具有更高的复发率和失败率[29]。布鲁菌入侵机体以后，体外药敏试验与体内抗生素性能之间的分离，也会导致治疗的失败[30]。因此，当布鲁菌入侵动物机体并在细胞内大量增殖后，彻底清除布鲁菌对机体的感染是一件极其艰难的事情。

3.3 布鲁菌的免疫逃避致病性布鲁菌通过脂筏侵入吞噬细胞和非吞噬细胞。脂筏介导布鲁菌进入细胞后，细胞内的致病性布鲁菌居住在胞内吞噬小体中，引起胞内吞噬小体中的EEA、Rab5和TFR呈阳性表达。致病性布鲁菌为了避免在胞内吞噬小体(BCV)中进一步与内源性细胞相互作用，于是与内质网相互作用和融合，产生一个来源于内质网的细胞器。布鲁菌的自我复制未能保持与内质网的相互作用，并通过与巨噬细胞的融合而降解。一旦致病性布鲁菌在复制的BCV中安全地进入内质网(ER)，布鲁菌就迅速发生分裂，通过表达毒力因子逃避溶酶体杀伤[31]。

布鲁菌能有效地定植单核吞噬细胞并在肝脏和脾脏中大量繁殖，大约有10%的细菌会对巨噬细胞、树突状细胞和其他抗原呈递细胞(APC)的吞噬产生抵抗力[32]。虽然，布鲁菌缺乏已知的细菌毒力因子，如溶胞菌素、胶囊、外毒素、分泌蛋白酶、菌毛、噬菌体编码毒素和毒力质粒[33-34]。但布鲁菌外膜中含有大量脂蛋白、含鸟氨酸的脂质、Br-LPS和相关多糖，可诱导弱的天然免疫。布鲁菌可以通过在含有获得EEA-1和Rab5抗原的液泡的脂质筏中内化，以及修改脂多糖(LPS)和鞭毛蛋白等毒力因子来逃避宿主免疫应答[35]。布鲁菌鞭毛蛋白不能诱导TLR5受体，是细菌在早期感染时逃避免疫系统的另一种途径[36-37]。布鲁菌感染的早期阶段对于逃避宿主免疫系统也是很重要的[38]。

3.4 绵羊种布鲁菌引起的细胞自噬细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。自噬是真核生物中一个高度保守的过程，细胞质、损伤细胞器、入侵细胞的病原微生物等被双膜囊状结构包裹，然后被送到溶酶体或液泡，被溶酶体酶解为大分子物质和杂质，大分子物质被细胞重新回收后利用，而杂质则被排至胞外[39]。

布鲁菌虽然能在巨噬细胞内大量增殖，但布鲁菌引起细胞内的自噬仍然是一个争论的问题。有研究表明布鲁菌可以引起上皮细胞发生自噬[18]，但巨噬细胞中却还没有检测到自噬性的胞内吞噬小体。一种假设是，自噬的发生可能是一种宿主自身存在的防御机制，在非吞噬细胞中普遍存在以抵抗入侵的细菌。这种自身存在的防御机制似乎仅限于非吞噬细胞。事实上，巨噬细胞似乎能有效地杀死致病性布鲁菌，机体受到布鲁菌感染后，80%～90%的细菌会因为机体自身的防御机制，在感染的最初几个小时内死亡，而上皮细胞的情况并非如此。然而，一些致病性细菌能够抵抗巨噬细胞的杀伤，并能够在巨噬细胞内生存和复制[40]。

4 防控

布鲁菌病的控制或消灭方案、方案的实施和不同国家的防制措施因本国国情不同而有很大差异[41]。虽然世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)提出了控制或根除布鲁菌病的战略或措施，但只有一些发达国家实现了免疫动物布鲁菌病的目标。尽管动物布鲁菌病的控制在一些国家取得了显著成就，但在大多数发展中国家和地区实现消灭仍是一项挑战。发展中国家没有人畜布鲁菌病的“一个健康”监测和控制系统，应特别努力为低资源国家推出更多的布鲁菌病控制方案[42]。对于布鲁菌病应该秉持以“预防为主”的原则，采取检疫、免疫、淘汰患病动物等综合性措施进行防控。在规模化养殖场中，科学的饲养管理是有效防控布鲁菌病的关键环节[43]。

4.1 疫苗接种由于布鲁菌主要为胞内寄生菌，抗生素对其治疗效果非常微弱，动物机体内的细胞免疫对抑制该病起了关键性作用。因此对布鲁菌病疫苗的研究主要集中在筛选弱毒株,构建突变株以及寻找亚单位疫苗等方面[44]。现如今全世界普遍使用的布鲁菌疫苗主要为S19、Rev-1和RB51。

目前，牲畜疫苗接种、血清学阳性携带者的频繁监测和屠宰是消灭该病的唯一有效手段[45]。虽然细胞免疫机制在免疫动物中被用来消灭布鲁菌[46]，但疫苗接种和对羊群的监控往往是无效的。菌株S19、RB51和Rev-1是经批准的布鲁菌属(Brucellaspp.)最常用于保护牲畜免受感染和流产的疫苗株。尽管Rev-1疫苗广泛用于预防绵羊的布鲁菌病[47]，但是它的使用会导致怀孕动物流产和不孕[48]，以及流产后阴道分泌物大量扩散到环境中。此外，由于它部分保留了其毒力特性，因此对接种疫苗的临床医生来说并不完全安全[48]。血清阳性动物的野生型菌株与疫苗株并没有血清学上的区别。再加上Rev-1偶尔引发的广泛免疫反应，对区分接种疫苗的动物和真正受感染的动物造成了重大障碍[49]。在绵羊，即使在某些情况下使用Rev-1疫苗，但是这些疫苗的制造商还没有澄清它的适用性[50]。王世雷等[51]通过采用布鲁菌病活疫苗(M5株)皮下注射和结膜囊点眼方式对330只羊进行免疫试验，研究发现布菌病活疫苗(M5株)适合非孕羊的免疫，且效果良好。MALEKI等[52]基于寡聚多糖(OPS)抗原和PLGA纳米粒子，研究开发出了一种抗恶性布鲁菌M16的纳米疫苗，纳米疫苗OPS-PLGA结合物免疫动物血清可促进布鲁菌的有效吞噬作用[52]。

4.2 非疫区动物群体的预防措施各地区畜牧兽医行政部门及动物疾病防控部门应当将布鲁菌病的防控提升为日常工作的重点，还应当强调预防措施的重要性，注意疾病免疫的科学性；在疾病高发时间内更应该注重动物的预防接种以减少布鲁菌病的扩散。对人类布鲁菌病是无法预防的，因为目前还没有有效的疫苗供人类使用。对于受感染的人，抗生素治疗是长期的，治疗可能导致重新接触微生物后复发或再次感染[46]。绵羊的养殖应该坚持自繁自养，需要引进绵羊时应从无疫病地区引进并对引进的绵羊进行严格的检疫。对于引进的绵羊进行2次以上的布鲁菌病免疫学检查，引入绵羊全群每次检查结果为阴性时，才可以将引入绵羊与当地绵羊混群养殖。

对绵羊群体进行定期的检疫和疾病监测，定期用免疫学方法对养殖绵羊全群或者抽样检查布鲁菌病，如果发现阳性动物，则立即按照布鲁菌病处理方法处理全部养殖的绵羊群体。

绵羊群体发生不明原因流产死亡时，应该怀疑为布鲁菌病，则需要立即将患病绵羊进行隔离，对绵羊排出的流产物和绵羊养殖区域进行严格的消毒处理。对流产胎儿和妊娠雌性绵羊进行诊断与检测，如为布鲁菌病，则该绵羊群体按照感染绵羊群处理。

4.3 疫区动物群体的防控措施严格执行定期检疫，对所有绵羊每年进行2次疾病检疫，检疫出的患病动物要进行严格的隔离饲养，严禁与健康的绵羊发生接触。对感染的绵羊群体，以免疫学方法进行反复多次检疫，检出患病动物应该立即淘汰，而血检阳性动物，应该隔离饲养，避免与健康动物接触，这样逐步检疫净化，直至绵羊群动物均为阴性。严格执行消毒等兽医卫生措施，对于饲养绵羊的圈舍要定期进行严格消毒，发现雌性绵羊流产时要对流产物进行彻底的无害化处理，同时对污染的环境要严格消毒。饲养绵羊过程中可以采用免疫增强剂和免疫调节剂，它可以增强绵羊体内巨噬细胞的活性，从而增强对布鲁菌的免疫能力[55-58]。

ELDERBROOK等[59]通过对美国怀俄明州家养绵羊种布鲁菌血清学及危险因素进行分析，表明老年绵羊(≥6岁)在各年龄组中血清阳性率最高。因此，我们建议将幼龄公羊与老龄公羊分离饲养，以减少繁殖季节以外疾病的传播。由于巨噬细胞内布鲁菌的生存能力和治疗周期长，复发成为了本病的主要挑战，尤其是治疗后的复发。因此，HOSSEINI等[60]研究发现多西环素包裹固体脂质纳米粒对布鲁菌的治疗作用明显，并且可避免疾病复发。

自20世纪90年代以来，我国布鲁菌病的发病率逐步增加，特别是我国西北部分地区相继报道发现绵羊种布鲁菌，该病发病率的增加给我国绵羊养殖业带来了巨大的经济损失[53,61-65]。布鲁菌病已被国家农业部列为二类疫病，因此有效防控布鲁菌病有助于阻止动物疫病的传播和减少绵羊养殖业的经济损失，对保障畜牧业可持续发展和公共卫生安全具有重要意义。对绵羊布鲁菌病防控进行总结，对绵羊种布鲁菌目前已有的研究进行归纳分析，为未来研究绵羊种布鲁菌致病机制和预防绵羊布鲁菌病提供了一定的理论基础。