基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异与演化

张振东，曲向阳，徐孝宙，邢军*

(1.江苏科技大学生物技术学院，江苏 镇江 212018；2.南京博维特健康管理有限公司，江苏 南京 211800；3.江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以母猪的繁殖障碍、生长猪的呼吸道疾病以及感染猪的继发感染为主要症状的重要疫病。从全球范围看，除澳大利亚、新西兰、瑞士、挪威、芬兰和瑞典等国家无PRRS疫情外，其他养猪生产国家均无一幸免。PRRS在我国习惯被称为“猪蓝耳病”，疫情更为复杂。

PRRSV是一种呈球形、有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子大小为60～65 nm，全长基因组约15 kb。2016年，国际病毒学分类委员会(ICTV)将PRRSV、小鼠乳酸脱氢酶病毒(mouse lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和大鼠动脉炎病毒1(rat arterivirus 1)归为套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)猪动脉炎病毒属(Porartevirus)，基因1型和2型PRRSV也被重新定为2个种，分别称为PRRSV1和PRRSV2[1]，我国主要以PRRSV2的流行为主。PRRSV极易变异与重组，宿主的天然免疫和特异性免疫因素，以及其他筛选压力加速了病毒核苷酸的突变，而当两株或多株病毒同时感染同一宿主时又可发生高频率的重组。此外，PRRSV异源毒株间交叉保护性差，变异毒株、演化毒株及重组毒株等新毒株的出现往往导致新疫情的流行。因此，自20世纪80年代出现以来，PRRSV的分子流行病学和遗传变异问题一直是关注的热点，本文就PRRSV 2毒株在遗传演化方面的研究进展进行了综述，以期为PRRS的免疫防控提供参考依据。

1 PRRSV2的遗传演化与多样性

1.1 PRRSV2自然流行毒株的变异与演化

PRRSV2于1987年在北美北卡罗来纳州首先暴发后，随即迅速在北美洲地区广泛流行并传播至其他国家和地区。1992年，Benfield等[2]从组织病料中首次分离到原型毒株VR-2332。随后在亚洲一些国家或地区也相继暴发PRRS疫情并分离到PRRSV毒株，且多与北美地区的分离株高度同源，这说明疫情的暴发极有可能与从疫区引进种猪或其他相关产品的进出口贸易有关[3]。PRRSV暴发后在各个国家和地区进行着独立的变异和演化，大量的PRRSV序列和毒株被检测以及分离。Shi等[4]基于8 624个ORF5基因序列进行了PRRSV2的遗传演化分析，该结果得到了大家的认可并被广泛引用。在该分析中PRRSV2被划分为9个谱系(lineage)，相邻谱系间的遗传演化距离至少为10%以上，超过85%的序列分布于4个大的谱系，即：谱系1、5、8和9，剩余毒株分布于5个小的谱系，谱系内又根据演化距离7%为阈值划分为不同的sub-lineage，比如谱系8和9分别包括9个和17个sub-lineages。PRRSV2原型毒株VR-2332、中国BJ-4、韩国PL97-1以及丹麦等国家早期分离株属于谱系5[3,5]，该谱系毒株最具“国际范”，在多个国家和地区流行，这可能与疫苗毒Resp/PRRS MLV在全球范围内的广泛使用有关。加拿大的早期分离毒株IAF-EXP91属于谱系1[4,6]，该谱系在系统发育树中位于根的位置且其中的毒株大部分来自加拿大的魁北克，而目前记录的最早的PRRSV阳性血清发现地也是位于加拿大，因此普遍认为PRRSV2起源于加拿大。1996年，泰国学者第一次在其国内分离到PRRSV2毒株，其与IAF-EXP91同源关系最近，属于谱系1。美国明尼苏达州出现以nsp2存在131个氨基酸不连续缺失为特征的变异株MN184[8]，进化树分析其属于谱系1，推测其是加拿大谱系1传入后的变异演化株。Brockmeier等[9]报道了演化于MN184的高毒力毒株NADC30，该毒株分离于2008年并于2013年开始传入中国[10]，造成了我国PRRS新疫情的发生和再度流行。最新研究发现，NADC30-like毒株已经在韩国出现并流行[11]。1996年夏天，美国暴发严重型PRRS[12]，分离毒株属于谱系8和9，而中国1996年首次分离到的PRRSV毒株CH-1a同样属于谱系8，这是否与美国暴发的严重型PRRS有关值得探讨。随后，在一段相当长的时间内，中国PRRSV分离株以谱系8为主，包括2006暴发的以nsp2高变区30个氨基酸缺失为特征的HP-PRRSV，HP-PRRSV流行于东南亚地区的[13]。谱系9毒株主要流行于美国、日本、墨西哥和意大利等地区，包含了当时数据库中大部分的PRRSV序列(2 800/8 624)。台湾分离株MD-001、中国分离株FJ-1以及香港地区扩增到的部分PRRSV序列属于谱系3。2005年之后基本上未分离到该谱系毒株，但近年来中国东南部地区重新出现谱系3毒株，并具有小范围流行趋势[14]。谱系2、4、6和7内的毒株数量少，曾在不同的地区散发流行，近年来未见有关这几个谱系内毒株的文献报道。2013年美国出现ORF5 RFLP 1-7-4(NADC34)分支的PRRSV毒株并正在多个地区流行[15]，其以nsp2编码区100个氨基酸的连续缺失为特征，2017年下半年，我国分离到NADC34-like毒株[16]。

1.2 PRRSV2疫苗毒株及重组毒株的变异与演化

常用的PRRSV2减毒活疫苗(MLV)有“Resp/PRRS”(亲本毒株为VR-2332，谱系5)、“ATP”(亲本毒株为JA142，谱系8)、“CH-1R”(亲本毒株为CH-1a，谱系8)、“R98”(亲本毒株为R98，谱系5)、“HP-PRRSV MLV”(亲本毒株为HP-PRRSV，谱系8)以及于2000年退出市场的“PrimePac”(亲本毒株为Neb-1，谱系7)。在丹麦使用过Resp/PRRS减毒活疫苗的猪场暴发PRRS疫情，从弱仔和死亡猪只中分离到的毒株与疫苗毒高度同源，这也是欧洲地区的第一个PRRSV2案例[17]；同时，从丹麦地区未免疫过PRRSV疫苗的猪场分离到毒株DK-1997-19407B，该毒株与疫苗毒Resp/PRRS的全基因组核苷酸同源性高达99.4%[18]，而Kvisgaard等[19]对丹麦地区15年内分离到的PRRSV2毒株进行分析，发现多数与疫苗毒有关，这说明PRRSV疫苗毒不仅可以返强，而且会在一个地区内广泛的传播和流行。另外，意大利、澳大利亚、波兰以及匈牙利等多个国家也分离到PRRSV2的疫苗演化毒株[17,20-21]。1998年美国爱荷华州一未免疫猪场暴发PRRS疫情，经研究分析证实，该疫情是由Resp/PRRS疫苗返强毒株98-37120-2引起[22]。在我国，从未使用过HP-PRRSV弱毒苗的猪场分离到3株JXA1-P80的返强毒株NT1、NT2和NT3[23]，Yu等[24]2014年分离株JX2014T2全基因组核苷酸同源性与TJ野毒株高度同源，且其nsp2区域存在TJM-F92特有的120个氨基酸缺失，说明JX2014T2为TJM-F92的返强毒株，而Zhang等[25]从一个猪场也分离到了两种疫苗毒HuN4-F112和TJM-F92的演化毒株HeN1201与HeN1301。

1996年，Kapur等[26]在对田间10个分离株横跨ORF2-7的片段进行分析时，第一次发现并报道了PRRSV2田间毒株的重组现象。Yuan等[27]在细胞水平上证实了PRRSV2可发生较高频率的重组而产生新的病毒。随后，来自美国、墨西哥以及中国等多个国家和地区的专家学者检测到了PRRSV2重组现象的发生[28-30]，但绝大多数都是基于ORF5序列的分析，真正分离到的重组病毒并不多见，这可能与亲本病毒更强的竞争优势有关[27]。Li等[31]从发病仔猪身上分离到了疫苗毒株CH-1R和高致病性毒株WUH1的重组毒株Em2007，这是PRRSV2疫苗毒株与田间毒株发生重组的首次报道。Shi等[28]研究发现，2009至2010年中国高致病毒株的再次流行就是源于HP-PRRSV与经典毒株的重组。对全球范围内PRRSV毒株的系统分析，也进一步证实了重组是发生于PRRSV毒株间的一个普遍现象。将同属于PRRSV2谱系8的两个毒株JXwn06-81c和HB-1/3.9c共感染猪，结果表明两毒株在猪体内可发生重组，且重组模式多样和复杂[32]。早期报道的重组基本上是发生于同谱系内的毒株或者说具有高度同源性的两个亲本毒株之间，鲜有报道不同谱系毒株或者说同源性偏低毒株的重组现象。Lu等[33]分析发现，GM2是由野外新流行毒株QYYZ(谱系3)与疫苗毒株Resp/PRRS(谱系5)的重组病毒。NADC30毒株(谱系1)2013年传入中国，其表现出了与我国毒株极易重组的特性，尤其是与疫苗毒或疫苗演化毒(谱系8的HP-PRRSV MLV，谱系5的Resp/PRRS MLV)，这可能与PRRSV减毒活疫苗在我国的广泛使用有关。大量的重组毒株被分离报道，甚至出现了三四个谱系等多谱系毒株重组的现象，重组模式亦越发复杂[10,34]。

2 我国PRRSV的遗传演化与多样性

PRRS最早在我国台湾地区暴发，1991、1992年先后分离到毒株MD001和WSV。WSV与PRRSV2原型毒株VR-2332高度同源，属于谱系5；而MD001进化树上形成独立的分支，属于谱系3。基于MD001和WSV两个原型毒株，台湾地区PRRSV主要分布于两个群体且以MD001群体为主[35]。在大陆地区，我国动检部门在1995年从加拿大引进的种猪中检测到了PRRSV抗体阳性猪[3]，郭宝清等[36]率先从发病猪场流产胎儿样本中分离到毒株CH-1a，随后，杨汉春等[5]分离到BJ-4。虽然CH-1a最早被分离，但其全基因组序列与VR-2332差异较大，该毒株是否发源于我国、或是由其他国家和地区传入尚无定论，但学者普遍将其归为我国的本土毒株。BJ-4与VR-2332高度同源，属于谱系5，进化树上其与VR-2332的疫苗毒株RespPRRS亲缘关系更近，推测该毒株是由引进疫苗免疫种猪、私自使用减毒活疫苗或者其他相关产品的贸易活动而传入我国。自上世纪90年代出现以来，PRRSV在2～3年内便迅速传播至我国各个地区，并在复杂的环境中进行着变异与演化[37]。Gao等[38]从河北地区分离到两株CH-1a的演化毒株HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002，其中HB-2(sh)/2002的nsp2和GP3区域分别存在12个和1个氨基酸的缺失，这是我国首次分离到的基因组天然缺失毒株。2004年分离毒株NB/04的nsp2编码区存在1个氨基酸的缺失(第481位)。2006年，我国猪群出现以高热、高发病率和高死亡率以及妊娠母猪严重的繁殖障碍为特征的HP-PRRSV，其nsp2编码区存在不连续的30个氨基酸缺失(第481位，531-561位)[39]，虽然Zhou等[40]已经证实该缺失与其致病力无关，但该特征作为HP-PRRSV的分子标志常被用来进行流行病学调查。此后数年内，HP-PRRSV及其演化毒株成为了我国田间的主要优势流行毒株。

据Han等[41]研究报道，自2006年HP-PRRSV暴发以来，我国的PRRS疫情可分为3个流行阶段。2006至2008年以最初暴发的具有高同源性的HP-PRRSV为主，2007年到达流行的高峰。Li等[42]人的研究进一步证实了该结果，其发现2007年629分样品中HP-PRRSV的检出率高达64.86%，而未检测到经典毒株。第二阶段为2009至2012年，PRRSV毒株之间的重组活动导致了疫情的再度流行[28]，并且自该时期开始PRRSV变异与演化的速率呈现出明显加快的趋势，特别是nsp2编码区不同缺失、插入及突变类型的新毒株和重组毒株的出现，可能与HP-PRRSV减毒活疫苗的逐步推广使用有关。2013年以来为第三阶段，近年来HP-PRRSV似乎已经“销声匿迹”，生产中由其引起的疫情已不多见，取而代之的是散发的病例和一些亚临床感染，分离到的毒株多数是HP-PRRSV疫苗毒、疫苗演化毒株及其与NADC30-like毒株的重组毒株[25,34]。2017年下半年，我国分离到nsp2编码区100个氨基酸的连续缺失为特征NADC34-like毒株[17]，其是否会造成新的流行，需要我们的不断监测和持续跟踪。以QYYZ为代表的PRRSV2谱系3毒株自2010年开始在我国东南部地区重新流行并有扩大范围之势，近年来该谱系的分离毒株越来越多[33]。另外，据Gao等[43]的认为，2011年在我国新疆地区首次出现属于谱系9的毒株，在进化树上形成独立的小分支。

为控制我国暴发的HP-PRRSV，自2011年以来，多种HP-PRRSV减毒活疫苗(JXA1-P80、HuN4-F112、TJM-F92以及GDr180)被开发和广泛使用[44-47]，虽然对PRRS的防控起到了一定的作用，但由于人们对疫苗的过分依赖及无序使用，导致了疫苗毒在田间的持续流行和传播，甚至出现了疫苗毒返强的现象，增加了不同毒株间重组的可能性，致使我国PRRS疫情更为复杂[41]。Jiang等[26]和Yu等[27]从猪场分离到的JXA1-P80和TJM-F92的返强毒株对仔猪具有致死性毒力。同谱系、不同谱系以及多个谱系之间的重组毒株越来越多，尤其是疫苗毒及其演化毒株与自然野毒株或新传入毒株的重组现象值得特别关注。

3 展望

开展PRRSV分子流行病学研究，深入探讨和揭示PRRSV的遗传演化规律，对PRRS的提前预警和及时防控具有非常重要的意义。由于毒种的多样性、RNA病毒聚合酶的低保真性、免疫压力，以及病毒之间的相互重组等多方面的的因素，PRRSV具有广泛变异和快速演化的能力，变异株、新毒株层出不穷，30多年来，大量的PRRSV毒株被分离。此外，PRRSV减毒活疫苗在发挥其保护作用的同时也表现出了明显的负面影响，疫苗返强毒株时有报道，而“铺天盖地”式的免疫策略使猪场内病毒的本底加大，进而导致疫苗毒株或疫苗演化毒株与自然野毒株之间的重组几率大大增加，重组毒株越来越多。因此，盲目使用、过分依赖减毒活疫苗只能是一种恶性循环，这也十分不利于PRRSV的净化工作。对于PRRS的防控，重视猪场的内外部生物安全仍是根本之策，合理使用疫苗(阴性场不使用疫苗，一个场仅使用一种疫苗等)，加强引种时的隔离检测，适当采取活毒驯化、闭群、清群和种群更新等控制措施，减少PRRSV的传播、延缓变异与演化的速度，从而降低疫情发生的概率。