鼠疫疫苗的临床应用及研究进展

魏东 综述，王国治，赵爱华 审校

中国食品药品检定研究院结核病和过敏原产品室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京102629

鼠疫（plague）是由鼠疫耶尔森菌（Yersina pestis）（简称鼠疫菌）引起的一种烈性传染病，其传染源主要是啮齿动物，传播媒介主要是鼠蚤。鼠疫对人类的影响至少有1 500年的历史，对社会和经济均造成巨大影响［1-2］。历史上的3次鼠疫大流行中有近2亿人感染死亡，我国在3次流行中均发生了疫情，而且第3次大流行始于我国［3］。

目前，世界范围内鼠疫自然疫源地并未缩小，加上经济差异造成各国卫生条件参差不齐，鼠疫仍时有暴发［4］。2017年8月，非洲马达加斯加暴发了严重鼠疫疫情，8月1日—11月26日，感染2 414例，其中78%为肺鼠疫［5-6］。2019年11月，北京确诊2例由内蒙古输入的肺鼠疫。因此，国际上将鼠疫称为一种再发性疾病［7-9］。

为预防鼠疫，美国自1942年开始生产灭活全菌体鼠疫疫苗（Plague vaccine，USP），是将鼠疫菌195／P强毒株经甲醛灭活处理制备而成。该疫苗有效性的间接证据是在越南战争中预防了美军士兵腺鼠疫的发生。但该灭活疫苗副反应较大，而且对肺鼠疫预防作用较差［10-12］，在1999年停止生产［13］。

新研制的鼠疫亚单位疫苗处于临床研究或临床后上市审批阶段，当前可及的人用疫苗主要是减毒活疫苗。1929年，GIRARD和ROBIC在马达加斯加的一名鼠疫患者体内分离到1株鼠疫菌，经5年16~20℃传代培养获得EV减毒株。1936年，前苏联开始使用该疫苗，目前许多前苏联国家、中国及蒙古等国家仍使用鼠疫EV株减毒活疫苗［14-15］。

鼠疫传染性强，病死率高，我国将其列为甲类传染病之首，其也是国际上公认的致死性生物武器［16-17］，而且有可能出现抗生素耐药菌株的感染［18-20］。近20年来，国内外对鼠疫的基础研究较为深入和充分，基本形成了以F1荚膜抗原（F1 capsular antigen，F1）和低钙V反应抗原（low calcium response V antigen，LcrV或V）为鼠疫疫苗主要成分的共识。在动物试验中，以这两种抗原为主要成分的疫苗均显示出较好的保护效果，可预防腺鼠疫及肺鼠疫［21-26］，部分疫苗已完成Ⅱ期临床研究。本文就鼠疫减毒活疫苗的临床应用及鼠疫亚单位疫苗的临床研究进展作一综述。后3个月的抗体阳转率为5%～15%。使用250个最小致死量（minimum lethal dose，MLD）的鼠疫菌强毒株皮下感染，免疫后3、6个月的保护率分别为100%、75%。该结果表明，即使血清中未检测到F1抗体，仍具有较好的保护效果，可能是鼠疫活疫苗诱导产生的复合抗体和细胞免疫发挥了保护作用。

1 减毒活疫苗

2 亚单位疫苗

2012年，FEODOROVA等［27］对鼠疫活疫苗免疫人群的长期血清学标志物进行了筛选，检测血清来自5～30年内多次免疫人员，距末次免疫4～30年。采用免疫印迹法进行抗体检测，检测用抗原为F1、LcrV、外膜蛋白分泌蛋白F（Yop secretion protein F，YscF）、外膜蛋白M（Yersiniaouter protein M，YopM）、纤溶酶原激活物（plasminogen activator，Pla）。针对F1、LcrV、YscF、YopM抗原的抗体阳性率分别为57%、26%、36%、10%，而针对Pla抗原的抗体阳性率高达82%。该研究表明，鼠疫活疫苗多次免疫可诱导长期的抗体应答，同时也为长期的免疫血清学监测指标及新的鼠疫诊断方法提供了研究方向。

2014年，FEODOROVA等［28］对鼠疫活疫苗免疫后针对F1和YscF抗原的抗体亚类进行了分析，结果表明，针对F1抗原的抗体亚类主要是IgG1，此外，有少量的IgG2和IgG4。针对F1抗原的IgG1抗体可维持20年，表明该疫苗有很好的免疫持久性。针对YscF抗原的抗体亚类主要是IgG1，但未检测到IgG2和IgG4抗体。这是首次对鼠疫活疫苗免疫后F1和YscF抗体亚类进行分析。

SAGIYEV等［29］对2014～2015年哈萨克斯坦阿拉木图地区鼠疫活疫苗接种人群进行了免疫应答研究，将鼠疫活疫苗免疫493人，其中352人免疫1～4次，141人免疫5次以上。分别在末次免疫后4、8、12月，采用间接血凝法测定血清中针对鼠疫菌F1抗原的抗体滴度，以1∶160作为抗体阳性判定标准。结果表明，对于首次免疫人群，免疫后4、8、12月的抗体阳转率分别为19%、8%、6%；对于多次免疫人群，抗体阳转率分别为49%、23%、16%。国内的晏慧芳［30］也曾开展鼠疫活菌苗接种人群血清学反应的研究，对F1抗体阴性人群分别在0和10 d进行鼠疫活疫苗皮上划痕免疫，采用间接血凝试法测定血清中针对F1抗原的抗体，以1∶20作为阳性判定标准。免疫后1个月阳转率仅为2%，免疫后3及6个月阳转率均为0。该研究的血清学判定标准及检测结果均低于SAGIYEV等［29］的数据。同时该研究进行了免疫豚鼠的抗体测定及保护力评价，免疫

近年来，鼠疫亚单位疫苗一直是研究热点。其中除F1、V抗原外，YscF［31-32］也具有较好的保护效果。外膜蛋白YadC［33］及YopD［34］对F1抗原阴性的鼠疫菌具有一定的保护效果。pH6抗原（也称PsaA）［35］、Pla［36］、其他几种外膜蛋白（YpkA、YopE、YopH、YopK、YopN［34］、YopM［37］）、ATP结合盒蛋白转运蛋白［ATP-binding cassette（ABC）transporter proteins］［38］等均无明显保护作用。目前，进入临床研究的鼠疫疫苗均以F1和V抗原为主要成分。

2.1 重组F1和V抗原疫苗 英国PharmAthene公司研制了由大肠埃希菌重组表达的F1和V抗原与氢氧化铝组成的鼠疫疫苗。在Ⅰ期临床研究中，分为4个剂量组，每种抗原剂量分别为5、10、20和40 μg，1、21 d各免疫1次。各剂量组针对F1和V抗原的抗体水平均在初次免疫后1个月左右达到高峰，随后出现了降低的趋势。各剂量组外周血中CD19+B、CD3+CD4+Th和CD3+CD8+CTL表达水平与免疫前无差异，但进行相应表型细胞数量测定之前未用抗原对细胞进行体外刺激。在被动免疫保护研究中，将各剂量组初次免疫后35 d的原倍血清以及分别混入25%、50%、75% PBS的血清经腹腔注射BALB／c小鼠，注射体积均为0.5 mL，以鼠疫疫苗免疫食蟹猴获得的血清为阳性对照。注射后2.5 h用10 CFU（相当于10 MLD）鼠疫菌GB株进行皮下感染，观察期为10 d。结果表明，除5 μg剂量组外，其他剂量组均有一定的保护效果，但仅40 μg剂量组的保护水平与阳性对照血清相当，该剂量组的血清中混入25% PBS时，动物存活率为100%，而注射原倍血清的动物存活率为60%［39］。

为进一步评价该疫苗对气溶胶感染的保护效果，GRAHAM等［40］对Ⅱ期临床研究中40、80及120 μg剂量组人群免疫后35、196及365 d的血清进行被动免疫保护力研究。各剂量组均取混合血清250 μL经腹腔注射BALB／c小鼠，3～6 h后用10.6～13.9半数致死量（median lethal dose，LD50）鼠疫菌CO92株进行气溶胶感染。结果表明，免疫后不同时间点各剂量组血清免疫动物的死亡中位时间（median time to death，MTD）均显著高于阴性血清对照组，MTD延长1～2 d，但不同剂量组间的MTD无显著差异。对全部保护力试验汇总结果的分析表明，MTD与F1和V抗体水平均有较好的相关性。同时，该研究比较了不同品系小鼠对被动保护评价的影响，在相同试验条件下，Hsd：NIHS小鼠的MTD高于BALB／c小鼠，表明Hsd：NIHS小鼠可能更适于临床血清被动免疫保护力的评价研究。

2.2 重组F1-V融合抗原疫苗 美国DynPortVaccine公司（DVC）研制了由大肠埃希菌重组表达的F1和V融合抗原与氢氧化铝组成的鼠疫疫苗。该疫苗最初是由美国陆军传染病医学研究所（United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases，USAMRIID）研制的［41］。研究用血清来自Ⅱa期临床试验中39名受试者，在3针次免疫（0、28、182 d或0、56、182 d）结束后14、28 d（196、210 d）采血。为满足样本使用量，将每名受试者196和210 d的血清进行等量合并。取0.5 mL血清，经腹腔注射Swiss Webster小鼠，每名受试者血清注射10只小鼠为1个试验组，24 h后用23 LD50（3～76 LD50）的鼠疫菌CO92株进行气溶胶感染，全部血清的被动免疫保护试验分3次进行。感染前2～3 h采集小鼠血清，测定针对F1抗原、V抗原及F1-V融合抗原的抗体水平。结果表明，35个试验组中有3组小鼠存活率超过50%，各免疫组中位生存期（median survival time）为3.9～13.9 d，显著高于阴性血清对照组（平均2.7 d）。小鼠的循环抗体水平与中位生存期相关性分析结果表明，第1次试验中仅F1抗体水平与中位生存期显著相关，第2次试验中3种抗体水平均与中位生存期显著相关，第3次试验中V抗体及F1-V抗体水平均与中位生存期显著相关。免疫人群血清中抗体水平与动物的中位生存期相关性分析结果表明，在后2次试验中，免疫后196 d血清的3种抗体水平均与动物的中位生存期显著相关。同时，该研究也比较了不同血清注射体积对中位生存期的影响。可能是由于动物数量原因，虽然中位生存期结果差异无统计学意义，但1 mL剂量组的中位生存期大于0.5 mL剂量组，这为后续研究提供了很好的启发［42］。

2.3 重组Flagellin／F1／V融合抗原疫苗Flagellin／F1／V疫苗是大肠埃希菌重组表达的鞭毛蛋白-F1-V融合抗原组成的鼠疫疫苗，其中的鞭毛蛋白来自肠炎沙门菌，其去除了586～1 134位核苷酸编码的超变区域［26］。鞭毛蛋白具有佐剂作用，其为TLR5激动剂，能诱导黏膜免疫及系统免疫应答［43-45］。

2017年，FREY等［46］报道了Flagellin／F1／V疫苗的Ⅰ期临床研究结果。受试者为60名18～45岁健康人群，分别设置了1、3、6及10 μg抗原剂量组，0、28 d各免疫1次。免疫后均未出现严重副反应，能产生针对F1、V及鞭毛抗原的特异性抗体，具有较好的量效关系，但加强免疫后鞭毛抗原的特异性IgG抗体效价未见明显增长。在细胞免疫应答检测中，对外周血单个核细胞经F1／V抗原体外刺激24 h后的培养上清进行细胞因子含量测定，但未检测到细胞因子的明显变化。

为进一步探索该疫苗的保护性相关免疫学指标，HAMZABEGOVIC等［47］对该疫苗Ⅰ期临床研究样本再次进行了检测分析。将6及10 μg抗原剂量组免疫前、末次免疫后14、28 d的血清和外周血单个核细胞分别进行功能性抗体及T细胞免疫分析。在功能性抗体评价中，测定了血清中巨噬细胞保护性抗体活性，其原理为检测血清中针对V抗原的抗体对表达V抗原重组假结核耶尔森菌的中和活性，测定的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）倒数水平越高，则对巨噬细胞保护力越强。结果表明，末次免疫后14、28 d，caspase-3倒数水平较免疫前分别增加29%、75%，而且，末次免疫后28 d的巨噬细胞保护水平与之前测定的血清V抗体效价显著相关，但与F1抗体效价无关。在T细胞免疫评价中，对之前的检测条件进行了优化，外周血单个核细胞经抗原体外刺激7 d后，进行T细胞的胞内因子表达水平及培养上清中细胞因子含量测定，结果表明，末次免疫后28 d，CD4+T细胞表达IL-10、IL-4及共表达TNF-α和IFNγ的水平较免疫前显著升高；末次免疫后14 d，培养上清中IFNγ水平较免疫前显著升高。同时，该研究也发现，末次免疫后14 d，巨噬细胞保护水平与IFNG（IFNγ）基因表达正相关，与ENSG00000225107基因表达负相关。该研究为疫苗保护性相关指标的筛选提供了新的思路。

2.4 天然提取F1抗原和重组V抗原疫苗 兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫疫苗已经完成Ⅱa期临床研究。该疫苗由天然提取的F1抗原和大肠杆菌重组表达的V抗原组成，以氢氧化铝为佐剂。受试者为240名18~55岁健康人群，分为15 μg及30 μg抗原剂量组。0、28 d各免疫1次，免疫后未出现严重副反应。F1抗体在免疫后6个月达到高峰，免疫后12个月仍高于56 d抗体水平。免疫后6个月及12个月30 μg剂量组的F1抗体水平显著高于15 μg剂量组。V抗体在免疫后6个月显著降低，两个剂量组的抗体水平及阳转率无显著差异［48］。

2017年，焦磊等［49］对该鼠疫疫苗Ⅱa期临床血清被动免疫保护力水平与抗体效价的相关性进行了分析，将BALB／c小鼠随机分为6组：含5个不同效价F1抗体和V抗体血清免疫组及阴性对照组，每组10只，每只小鼠经腹腔注射1.0 mL血清，各实验组动物在注射血清3 h后分别用6 MLD鼠疫菌141株皮下感染，对照组用2 MLD感染，观察期为14 d。结果表明，对照组小鼠感染后全部死亡，平均存活时间为6.5 d；不同效价（由低到高的顺序）血清注射组的动物存活率分别为10.0%、0.0%、40.0%、40.0%、90.0%，小鼠平均存活时间分别提高至9.1、9.9、11.2、11.4、13.9 d，动物的存活率和平均存活时间与Fl和V抗体效价均显著相关，表明该鼠疫疫苗Ⅱa期临床试验血清可对小鼠提供被动免疫保护。

3 展望

由于鼠疫发病率低，不能通过临床试验获得鼠疫疫苗的有效性数据。针对此类无法完成临床有效性研究药物的上市审批问题，2002年美国FDA发布并实施了动物法则“Animal Rule”［50］。该法则规定，对于已完成临床安全性评价，但由于伦理道德或不具有可行性等原因无法获得临床有效性数据的药物，可在提供能够推测人体有效性的动物药效学研究结果基础上申请直接上市使用。应用BioThrax炭疽疫苗进行炭疽暴露后预防是首次根据动物法则批准的增加适应症类疫苗［51］。

现有研究表明，针对F1抗原、V抗原或F1-V融合抗原的单克隆抗体或多克隆抗体对小鼠的皮下感染、滴鼻感染以及气溶胶感染均具有被动免疫保护效果［52-54］。小鼠被动免疫保护试验的保护指数（mouse protection index，MPI）小于10曾是USP疫苗的效力评价指标［55］。使用鼠疫疫苗临床受试者免疫血清进行小鼠被动免疫保护力评价是将动物保护力和人体免疫应答建立联系的有效方法。当前进入临床研究的鼠疫疫苗大都开展了临床血清对小鼠的被动免疫保护力评价研究［39-40，42，49］。但需注意的是，被动免疫保护研究可能会过高要求保护所需的抗体水平，因为在主动免疫的保护作用中除循环抗体外，记忆B细胞免疫应答也发挥了重要作用［56］。此外，细胞免疫也是鼠疫疫苗发挥保护作用的重要因素［57-59］，单纯的被动免疫保护力评价可能难以全面评估疫苗对人体的潜在保护效果。人与人之间传播的肺鼠疫是通过呼吸道感染，因此鼠疫疫苗的主动保护力及被动保护力评价中感染方式应采用滴鼻或气溶胶感染。2018年，WHO发布了鼠疫疫苗的目标产品概况文件（Target Product Profile for Plague Vaccines，TPP），用于指导鼠疫疫苗研制［60］。根据使用目的，鼠疫疫苗可分为常规预防及紧急预防用疫苗，其中紧急预防用疫苗应能够诱导快速的保护性免疫应答。紧急情况下高危人群可能会使用抗生素进行预防性治疗，因此以也应考虑进行鼠疫疫苗与抗生素的相互作用研究。研究表明，初次免疫和加强免疫使用不同种类疫苗的保护效果要好于同种疫苗免疫［61-62］。也可考虑联合使用不同种类鼠疫疫苗进行初次免疫和加强免疫研究，如用鼠疫活疫苗进行初次免疫，再用重组亚单位疫苗加强免疫等。

鼠疫是一种自然疫源性疾病，但也可能被用作生物武器，随着生物技术的快速发展，不排除耐药菌或经基因修饰后鼠疫菌被用于生物武器的可能。新型疫苗的研制，将对鼠疫的预防发挥重要作用。