高效液相色谱法测定青贮饲料桑中的乳酸、乙酸和丙酸含量条件探讨

王彦平， 刘公言#， 梁 萌， 朱良智， 赵雪艳，呼红梅， 唐伟静， 王继英， 王 诚*

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100； 2.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100；3.山东省饲料质量检验所，山东济南250022）

饲料桑也叫蛋白桑， 是通过杂交选育的富含蛋白质的草本桑新品系， 其营养价值高， 适口性好，并且含有多种生物活性物质，是一种不可多得的动物非常规饲料，具有极大的开发潜力（林国强等，2020；王诚等，2019）。 但是由于饲料桑中含有抗营养因子，例如单宁、植酸等，限制了其在畜禽养殖中的添加量，目前常用青贮来解决这一问题。青贮饲料的发酵过程即乳酸菌及其他微生物大量繁殖的过程， 因而研究其产物乳酸和挥发性脂肪酸的含量和组成比例是评价青贮饲料发酵特性及饲料品质的重要指标（张养东等，2016）。

对青贮饲料中乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）的测定一般采用羟基联苯比色法、 酶法、 气相色谱法、离子色谱法、液相色谱法等（陈松辉等，2018；宋凡等，2016； 高晓松，2012； 王洪丽等，2008；任清，2002）。比色法每次只能测定单个酸，不能几个酸同时测定，处理过程繁琐；气相色谱法可以实现VFA 和乳酸的同时测定，但需要提前对样品进行甲酯化或苄酯化， 操作过程较繁琐， 处理时间较长，不适宜于大批量样品的测定分析。乳酸脱氢酶法准确性好，测定快速，但测定成本较高。 目前通过液相色谱法检测有机酸的研究已有报道（邓虹等，2018；赵艳等，2015），但对青贮饲料中乳酸、乙酸等同时进行检测的报道并不多， 本实验室通过大量试验， 优化检测条件， 旨在建立一种结果准确、操作简单的检测方法，实现青贮饲料桑中主要酸成分乳酸、乙酸和丙酸的同步检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 青贮饲料取自本实验室2019年制作的青贮饲料桑样品；乳酸、乙酸、丙酸标准品（纯度≥99.95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈为色谱纯，磷酸、磷酸二氢钠为分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备 Waters E2695 型高效液相色谱仪，配备紫外/可见光检测器，沃特世科技（上海）有限公司；电子天平；超声波振荡器等。

1.3 实验方法

1.3.1 混合标准溶液配制 分别准确称取3 种物质的标准品，用去离子水溶解并定容于容量瓶中，配制成混合母液，然后准确量取0.625、1.25、2.5、5 mL 标准混合母液用超纯水定容于10 mL容量瓶中， 即为梯度混合标准溶液，4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 流动相配制 准确称取磷酸二氢钠0.02 mmol（3.0900 g）用去离子水溶解，用磷酸溶液调节pH 至2.7， 并定容于1000 mL 的容量瓶中，然后用0.45 μm 水相滤膜过滤， 超声波振荡器中脱气30 min 后使用。色谱级乙腈用0.45 μm 有机滤膜过滤，超声波振荡器中脱气30 min 后使用。

1.3.3 高效液相色谱分析条件 XSelect HSS T3-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钠 （pH 为2.7）=2.5:97.5（V/V）；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测器波长：210 nm。

1.3.4 样品处理 准确称取青贮饲料样品2.50 g，溶解于250 mL 具塞三角瓶中， 加入去离子水200 mL 并混匀。 在4 ℃冰箱中放置24 h（每间隔一段时间混匀一次），然后过滤，并清洗滤渣，定容于250 mL 容量瓶中。 取滤液适量用0.45 μm 滤膜过滤，即为待测样品。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱检测方法的建立

2.1.1 色谱柱、 流动相及流速的确定 实验室具有两种色谱柱，一种为通用C18 柱，一种为XSelect HSS T3-C18 柱，同样条件下，通用C18 柱乳酸与乙酸无法分离， 而XSelect HSS T3-C18 柱可以将二者分开，确定选择XSelect HSS T3-C18 柱。

流动相比较了0.02 mol/L 磷酸二氢钠（pH 为2.7）和乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钠（pH 为2.7）=2.5:97.5（V/V）作为流动性，各组分可以较好的分离，但仅用0.02 mol/L 磷酸二氢钠（pH 为2.7）作为流动相时，峰形稍差，且流动相易变质，故选择在0.02 mol/L 磷酸二氢钠中加入乙腈。

不同流速（1.0、0.8、0.6 mL/min）下分离实验发现，随着流速的增加，保留时间缩短，分离度降低，流速过低时分离效果较好，但洗脱时间延长，综合考虑，确定流动相为乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钠（pH 为2.7）=2.5:97.5（V/V），流速为0.8 mL/min。混合标准溶液液相色谱图见图1， 样品液相色谱图见图2。

图1 混合标准溶液液相色谱图

图2 青贮饲料桑样品液相色谱图

2.1.2 线性回归分析 取1.3.1 中配制的梯度混合标准溶液进样，以峰面积（响应值，Y，AU）为纵坐标，以标准品浓度（X，mg/mL）为横坐标，绘制3种标准品的标准曲线，得到保留时间、线性范围、回归方程、相关系数、检出限信息，结果见表1。 3种标准品的相关系数R2均大于0.999， 表明线性关系良好，可满足分析检测要求。

表1 3 种标准品保留时间、回归方程和检出限

2.1.3 回收率 将方法1.3.1 中配制的已知浓度的混合标准样品，添加一定量的不同浓度的乳酸、乙酸和丙酸标准溶液后混匀，进样，分别测定其中各物质的浓度，结果见表2。 3 种物质的平均回收率为101.20% ～104.24%， 相对标准偏差RSD 为0.01% ～0.49%，说明该方法准确性较好。

表2 3 种物质的回收率实验结果（n=3）

2.1.4 精密度 将方法1.3.1 中配制的混合标准样品，按照上述色谱条件，连续进样6 次检测3 种物质的浓度，6 次平行实验结果见表3。 3 种物质含量检测结果的RSD 为0.06% ～0.58%， 符合定量检测要求，说明该方法测定结果精密度良好。

表3 3 种物质测定的相对标准偏差

2.2 样品处理方法及加标实验 准确称取5 份青贮饲料桑各2.50 g， 放入250 mL 具塞三角瓶中，加入去离子水200 mL 并混匀。 具体处理方法见表4。 处理之后过滤并清洗滤渣，定容于250 mL容量瓶中。 取滤液适量用0.45 μm 滤膜过滤，测定。由表4 可见，室温条件下，随着时间延长，乳酸和乙酸的含量小幅度升高。 35 ℃条件下超声波振荡30 min，乳酸含量提高，但乙酸含量略有降低。4 ℃冰箱中放置24 h 测定乳酸和乙酸含量，发现两种成分含量最高， 故本实验选择4 ℃冰箱中放置24 h 制备待测样品。

表4 样品不同处理方法及3 种物质含量测定

另取4 份浸提液，其中一份直接上样检测，其余三份分别加入不同浓度的混合酸标准溶液测定回收率， 结果见表5。 样品中加标回收率为98.35% ～102.08%，适于检测该样品。

表5 青贮饲料桑样品测定及加标回收率测定实验结果

3 讨论与结论

在液相和气相色谱分析中， 精密度和回收率是评价检测体系稳定性和准确性常用的两个指标。 精密度指在规定的测定条件下， 用同一个样品，经过多次测定所得各个结果之间的接近程度。由此可见精密度越高检测方法越稳定。 而回收率是加标实测的结果减去未加标所测的结果， 其差值同加入标准物质之比即为样品加标回收率。 乙腈是高效液相色谱分析中常用的流动相溶剂，具有洗脱能力强，不易与待测物反应的优点（潘惠慧等，2008）。 流动相的pH 是影响待分析物分离效果的另一个重要因素。 赵景婵等（2012）认为流动相pH 直接决定了VFA 以何种形态存在，在检测中只有使流动相pH 控制在一定范围内， 才能抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，提高分离的选择性。 赵建军等 （1993） 应用C18 柱以KH2PO4缓冲液作流动相，对黄牛瘤胃内容物挥发性脂肪酸和乳酸进行了测定， 结果表明瘤胃内容物乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的平均回收率和变异系数均在可信线范围之内，表明该方法稳定性较好，精确度较高。 本试验通过对流动相、 流速和提取条件进行优化， 建立了以XSelect HSS T3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 为色谱柱， 流动相为乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钠 （pH 为2.7）=2.5:97.5（V/V），流速为0.8 mL/min 的高效液相色谱法，可以同时测定青贮饲料桑中的乳酸、乙酸和丙酸，该方法操作简单，且具有较高的精密度和准确性，适用于饲料桑类青贮饲料中乳酸、 乙酸和丙酸同时进行定量检测。