鸦胆子苦醇对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响

刘 丹，胥 旸，邢晓静

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110167；2.辽宁省肿瘤医院血液乳腺内科，辽宁 沈阳110042)

乳腺癌是发病率较高的一种恶性疾病，对健康有着极大的危害[1]。三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是指检查结果中孕激素受体(Progesterone receptor，PR)、雌激素受体(Estrogen receptor，ER)以及人类表皮生长因子受体-2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)表达均为阴性的一种特殊类型的乳腺癌[2]。三阴性乳腺癌患者在治疗过程当中缺少靶点，内分泌及靶向治疗导致患者预后差，复发转移率及死亡率很高促使人们探索有效的抗肿瘤药物[3]。近年来，中草药的抗肿瘤、抗癌症作用，越来越受人们的关注，鸦胆子苦醇(Brusatol，BRU)是中草药苦木科植物鸦胆子分离出的苦木内酯类成分之一喹诺酮[4]，具有抗肿瘤、抗炎症、抗病毒及抗寄生虫等多种药理活性[5]。近年来，研究发现鸦胆子可抑制肿瘤细胞的增殖和转移，并且能促进其凋亡，对乳腺癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]、胰腺癌[10]和结直肠癌[11]等多种癌细胞具有增殖抑制作用，本研究目的主要探讨鸦胆子苦醇对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制进而诱导细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂：三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株由辽宁省肿瘤医院中心实验室提供，鸦胆子苦醇(BRU)购自大连美仑生物技术有限公司(批号：F0818AS CAS:14907-98-3)，DMEM培养液购于HYCLONE有限公司，胎牛血清(FBS)购于CLARK公司 ，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma有限公司，胰蛋白酶购自GIBCO有限公司，PBS购于GENVEW有限公司，CCK-8试剂盒购自上海皓元生物医药科技有限公司，Annexin V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自北京义翘神州科技有限公司，细胞周期检测试剂盒购自凯基生物有限公司。

1.1.2 仪 器：CO2培养箱(Thermo scientific公司 德国)，超净工作台(安泰空气技术有限公司)，荧光显微镜(Leica公司)，全波长酶标仪(Bio-RAD公司)，高速离心机(Eppendorf公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 溶解药物：BRU用二甲基亚砜(DMSO)避光溶解，配制初始浓度为5 mmol/L，分装以待后用。

1.2.2 细胞培养及传代：三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞培养于配制的含12% FBS 的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，在倒置显微镜下每天观察细胞生长情况，根据情况2～3 d换液1次，当细胞生长到对数生长时即可进行传代培养，弃去旧培养液，加入PBS约1～2 ml清洗细胞再弃去PBS，加入1～2 ml胰蛋白酶(含EDTA)，在细胞培养箱中消化3 min左右，至细胞变圆脱离底部，立即取出培养皿，向其中直接加入6 ml左右新培养液终止消化，反复吹打皿底使之形成单个细胞分散的细胞悬液，收集细胞悬液到离心管中，800 r/min离心5 min后弃去上清，在离心管沉淀中加入新培养液10 ml左右反复吹打，直到细胞沉淀完全形成单个细胞分散的细胞悬液，将悬液一传四的移入培养皿内进行细胞培养，然后继续孵育，放于37 ℃ 5% CO2培养箱内。

1.2.3 用CCK-8法检测鸦胆子苦醇对细胞增殖抑制的影响：三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞以对数生长，密度调整为1×105个/ml，制备细胞悬液，并接种于96孔培养板中，每孔加100 μl，置于37 ℃饱和温度，5%CO2培养箱中继续孵育24 h，待细胞贴壁后，弃去旧培养液，实验组中分别加入10 μl不同浓度(5、10、20、40 μmol/L)的含药培养液，空白对照组加入10 μl DMSO，每个浓度梯度设5个复孔，置于37 ℃细胞培养箱中孵育24、48、72 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培养箱内孵育1～4 h，用全波长酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD值)，按照公式：抑制百分率=[(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，根据5个复孔的平均OD值来计算各药物浓度组细胞的抑制百分比，实验重复3次取平均值，计算IC50。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡：取处于对数生长的MDA-MB-231细胞，调整密度为3×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板中，每孔2 ml，待细胞生长达到70%左右时，据细胞增殖抑制实验得出的BRU的 IC50，实验组分别加入浓度为5、10、20、40 μmol/L的含BRU的培养液，空白对照组加入新培养液，培养48 h后消化收集细胞于离心管中，用4℃预冷的PBS清洗细胞2次，800 r/min 5 min离心后去上清，用1×Binding Buffer重悬细胞至细胞密度为0.1×107～1×107个/ml，将细胞悬液转移至一个流式管中，每管100 μl，在每管细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl 7-AAD，轻轻混匀，设置单染，双染以及对照，在室温(25 ℃)避光孵育15 min，加入400 μl 1×Binding Buffer终止反应，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率，Flow jov10软件分析，实验至少重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期：取对数生长的MDA-MB-231细胞，调整为密度3×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔的细胞培养板中，每孔2 ml，待细胞生长达到70%左右，实验组分别加入浓度为5、10、20、40 μmol/L的含BRU的培养液，空白对照组加入新培养液，培养48 h后，胰酶(无EDTA)消化细胞收集于离心管中，1000 r/min 5min离心后去上清，用预冷的PBS洗涤细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，2000 r/min 5 min离心后去上清，在细胞中加入提前准备好的体积分数为70%冷乙醇500 μl固定(2 h至过夜)，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液，1000 r/min 5 min离心后去上清，加入提前配制好的500 μl PI/RNase A染色工作液，室温避光30～60 min，流式细胞仪去上机检测，实验至少重复3次。

2 结 果

2.1 鸦胆子苦醇对MDA-MB-231细胞生长的抑制率 鸦胆子苦醇对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用显著，且具有时间和剂量的依赖性，24、48和72 h的生长抑制率分别为:19.58%～60.73%、26.11%～81.35%和29.19%～84.48%。且IC50值分别为23.71、13.49、10.27 μmol/L，各组间鸦胆子苦醇对MDA-MB-231细胞的抑制率比较，均具有统计学意义(均P<0.05)，鸦胆子苦醇对MDA-MB-231 细胞的生长抑制率随药物浓度的增加而增高，呈剂量-效应正相关，并且随着给药时间的延长对细胞的抑制作用也相应提高，呈时间-效应正相关。见表1。

表1 鸦胆子苦醇对MDA-MB-231细胞生长的抑制率

2.2 鸦胆子苦醇对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 鸦胆子苦醇作用MDA-MB-231细胞48 h后，结果显示(图1):鸦胆子苦醇对MDA-MB-231细胞有明显的凋亡促进作用，随着浓度的提高，细胞凋亡率也相应增加，5、10、20、40 μmol/L的BRU处理MDA-MB-231细胞48 h后，药物各浓度组之间差异具有统计学意义(均P<0.05)。表明鸦胆子苦醇可浓度依赖性的诱导MDA-MB-231细胞凋亡。

图1 不同浓度鸦胆子苦醇诱导MDA-MB-231细胞凋亡

2.3 鸦胆子苦醇对MDA-MB-231细胞周期的影响 用浓度为5、10、20、40 μmol/L的鸦胆子苦醇作用MDA-MB-231细胞48h后，结果显示，浓度越高，细胞G0/G1期的比例越高，S及G2/M期的比例则下降，与对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。说明BRU可阻滞MDA-MB-231细胞的增殖，使细胞生长阻滞于G0/G1期，并进而诱导细胞凋亡(图2)。

图2 不同浓度鸦胆子苦醇处理MDA-MB-231细胞后各周期比例

3 讨 论

近年来，随着乳腺癌的发病率越来越高，已成为多发病以及常见病,尤其三阴性乳腺癌是乳腺癌治疗中最棘手的一种，死亡率最高、且最容易复发，中医认为该病是多种因素交互错杂而生成的疾病，中医药在乳腺癌的治疗中的地位也日益提升，中药的有效成分对乳腺癌的基础性研究也越来越多[12]，鸦胆子为中草药苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，其性寒味苦，归大肠和肝经，是中国的传统中药，被收录于《中国药典》，鸦胆子具有清热解毒、杀虫、截疟、止痢等众多功效，可用于治疗热毒血痢、疟疾、鸡眼、疣等。现代药理活性研究表明，鸦胆子具有抗炎症、抗疟疾、抗病毒、抗肿瘤以及降血糖等多方面的作用，其中抗癌作用及机制现已有众多研究[13]，鸦胆子含有多种的化学成分，其中含量相对较高的成分则为苦木内酯类，并且具有较强的抗肿瘤，抗炎等多种生物活性[14]，鸦胆子苦醇则是苦木内酯的主要代表性化合物[15]，有学者研究发现鸦胆子苦醇可以快速而短暂的抑制结肠肿瘤细胞Nrf-2信号通路，降低胞内Nadph的水平，抑制DNA的合成，可抑制结肠癌细胞的增殖[16]。王敏等[17]研究发现鸦胆子苦醇可下调Nrf-2，降低Notch1及下游蛋白的表达，从而抑制了A549、H460细胞的增殖，并促使细胞凋亡。崔玲娣等[18]研究发现鸦胆子苦醇可抑制Nrf-2表达，并诱导ERS，较低剂量的鸦胆子苦醇可显著促进MCF-7细胞凋亡。本研究主要探究鸦胆子苦醇作用于三阴性乳腺癌细胞的作用，研究结果显示鸦胆子苦醇对三阴性乳腺癌细胞体外也有明显的生长抑制作用。其抑制作用随给药浓度的增加或作用时间的延长而增强，呈现明显的浓度和时间的依赖关系。已知从一个细胞周期阶段到下一个细胞周期阶段，包括分裂间期以及分裂期，分裂期即是M期，分裂间期包括G0/G1/S/G2期，若某一期出现异常，则细胞的分化，增殖将出现问题[19]。研究发现细胞G1期是周期启动的一个重要调控点，当细胞G1期出现异常则无法进入S期进行细胞周期[20]，实验结果显示，鸦胆子苦醇浓度越高，细胞G0/G1期的比例越高，S/G2/M期比例则减少，鸦胆子苦醇可以将三阴性乳腺癌细胞阻滞在G0/G1期，并且诱导其凋亡，细胞的凋亡率随着药物浓度的增加也显著增高，三阴性乳腺癌细胞的凋亡研究成为临床学者研究的一个热点，细胞的凋亡主要有内在途径和外在途径，与细胞生命活动有密切关系的线粒体，对细胞凋亡的调控也起到重要的作用，Bcl-2蛋白家族通过控制线粒体通透性来调节细胞凋亡，应进一步探究细胞的凋亡及其凋亡机制，为临床提供新的治疗方法。综上所述，鸦胆子苦醇对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞体外的生长有显著抑制作用，不仅能阻滞MDA-MB-231细胞的增殖并且能诱导细胞的凋亡，其是潜在的临床治疗三阴性乳腺癌的药物，后续将进一步研究鸦胆子苦醇促进三阴性乳腺癌细胞凋亡的具体机制。