棘孢木霉DQ-1分生孢子固体发酵优化及其对4种作物幼苗生长的影响

张 成，廖文敏，薛 鸣，陈 迪，侯巨梅，刘 铜*

（1.海南省绿色农用生物制剂创制工程研究中心（海南大学），海口 570228；2.海南大学植物保护学院，海口 570228；3.贵州益百亿生物科技有限公司海口研发中心，海口 570100）

木霉菌Trichodermaspp.广泛存在于土壤、森林、植株根际或叶面、树皮及枯枝落叶中，是一种重要的生防真菌[1]。木霉菌不仅可以通过竞争、重寄生和分泌次生代谢产物等方式抑制多种植物病原菌的生长，而且可以通过产生某些植物生长激素物质促进作物的生长[2-4]。由于木霉菌对环境安全，对农产品无污染，因此在绿色农业生产中的应用越来越广泛。

目前，已知的木霉菌有250余种[5]，其中以哈茨木霉Trichodermaharzianum、深绿木霉Trichoderma atroviride和绿色木霉Trichodermavirens等作为生防制剂应用最为广泛。最近研究发现，棘孢木霉不仅对植物病害有较好预防作用，并且对作物生长等方面有明显的效果。如覃柳燕等[6,7]鉴定的棘孢木霉 PZ6能提高香蕉苗根系活力及蕉叶SOD和CAT活性，并能够在一定程度上增强其对枯萎病菌的防御能力。刘明鑫等[8]发现棘孢木霉可显著促进黄瓜根系生长，并能有效防治立枯病。姜传英等[9]发现棘孢木霉可以有效提高山新杨的光合能力，促进山新杨幼苗生长。张宏祥等[10]研究发现棘孢木霉可在砷污染的土壤上缓解砷对小油菜的胁迫，并促进小油菜的生长。因此，棘孢木霉在绿色农业中的应用中具有潜在开发价值，但是目前国内利用棘孢木霉生产的生物制剂鲜有报道。

课题组在前期研究过程中发现一株具有较强抑菌促生作用的棘孢木霉DQ-1[11]。为了更好地利用和开发该菌株，本研究拟通过筛选和优化棘孢木霉DQ-1分生孢子固体发酵基质和条件，以期探明较高产孢量的棘孢木霉DQ-1固体发酵条件；并通过盆栽试验，研究其分生孢子粉对黄瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗生长的影响，为棘孢木霉 DQ-1分生孢子制剂开发及其在蔬菜作物上的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试生防菌棘孢木霉Trichoderma.asperellumDQ-1由海南大学植物保护学院木霉菌研究中心提供。PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL），固体发酵基质（麦麸、玉米粉、甘蔗渣、稻壳、水稻秸秆、硅藻土）。供试作物黄瓜“津丰A108”（海南晨锋种业有限公司），辣椒“热辣4号”（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所选育），番茄“千禧”（农友种苗有限公司），西瓜“黑美人”（农友种苗有限公司）。

供试盆栽基质（广州市生升农业有限公司）主要成分由椰糠、泥炭和炭化稻谷壳组成，碱解氮含量为112.81 mg/kg，有效磷含量为48.06 mg/kg，速效钾含量为374.95 mg/kg，有机质含量为2.93%，pH 7.52。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌分生孢子悬浮液制备 将棘孢木霉DQ-1从保存管中接种于PDA培养基上，于28 ℃恒温培养箱内培养5 d后在平板上加入灭菌水，用无菌接种环适当刮洗，在显微镜下用血球计数板测定孢子含量，重复3次[12]，制成含量为1×108CFU/mL的孢子悬浮液备用。

1.2.2 不同固体基质对棘孢木霉DQ-1产孢影响 将麦麸、玉米粉、粉碎后的甘蔗渣、稻壳、水稻秸秆（剪成3～5 cm）5种原料分别加入45%水后拌匀，各自称取20 g装于底面直径为70 mm、容积为200 mL的圆柱形组培瓶中，121 ℃高压灭菌20 min。待组培瓶冷却至室温，按0.5%的接种量（1×108CFU/mL的孢子悬浮液）接种到组培瓶中摇匀，放置于28 ℃恒温箱中培养，每2 d取出摇匀一次，断续培养5 d后取出。称取1 g发酵基质，以灭菌水稀释1000倍，用血球计数板法测量每克基质中的产孢量，试验重复3次。

1.2.3 不同比例的固体发酵基质正交试验 将单一发酵基质产孢量最优的3种原料麦麸、玉米碎粉、稻壳与硅藻土按照6.8:1:1.2:1的配比，总质量为20 g，含水量为45%装入培养瓶中混匀，作为固体发酵培养基。这4种成分作为正交试验的4个因素，每个因素设不同质量比例的3个水平，进行四因素三水平正交试验，共设计9个试验组（表1）。每个试验组重复3次，发酵方法和孢子含量测定方法与1.2.2相同。

表1 固体发酵正交试验设计(L943)Table 1 Design of orthogonal test for solid fermentation

1.2.4 接种方式、接种量及发酵时间对棘孢木霉DQ-1产孢的影响 采用固体（以纯麦麸发酵完成的木霉菌做固体发酵种子）和液体（1.2.1孢子悬浮液）接种方式，分别按0.5%、1%、2%、3%、4%质量接种量接种到麦麸:玉米碎粉:稻壳:硅藻土配比为6.8:1:1.2:1的固体发酵培养基上，每隔2 d取一次样品，用血球计数板测量孢子数，一直到第20 d。发酵方法和孢子含量测定方法与1.2.2相同，试验重复3次。

1.2.5 水稻秸秆代替稻壳对棘孢木霉DQ-1产孢量的影响 在单一基质中剪成段的秸秆（3～5 cm）产孢量较低，可能与秸秆长度有关，现将水稻秸秆分别剪成3、2、1 cm和用粉碎机打碎，将这4种经过不同处理方式的秸秆替代固体发酵基质中的稻壳，即麦麸:玉米碎粉:水稻秸秆:硅藻土＝6.8:1.0:1.2:1.0作为试验组，以发酵基质麦麸、玉米碎粉、稻壳、硅藻土配比为6.8:1.0:1.2:1.0作为对照组，比较稻壳和秸秆对棘孢木霉产孢的影响。每瓶装料20 g，于121 ℃高压灭菌20 min。发酵条件和产孢含量统计方法与1.2.2相同，试验重复3次。

1.2.6 浅盘固体发酵扩大培养及孢子粉的制备 在优化培养条件的基础上，利用浅盘固体发酵的方式将棘孢木霉DQ-1进行扩大培养，以满足批量生产的需求。先将培养基（麦麸、玉米粉、稻壳、硅藻土比例为5.8:0.5:1.7:1.0，含水量45%）和纱布灭菌，灭菌后把用纱布包好培养基放在浅盘中发酵，按固体接种方式接种，接种量为2%。浅盘尺寸为42 cm×29.5 cm，内装基质500 g，厚度约为3 cm，室内恒温28 ℃培养，每天翻动使其通风和放热，并用加湿器保持湿度。发酵 12 d后将其风干、粉碎、过筛，获得棘孢木霉菌DQ-1孢子粉，测定每克孢子数。

1.2.7 棘孢木霉DQ-1孢子粉对黄瓜、辣椒、番茄、西瓜幼苗生长的影响 试验于2019年9—12月在海南省中国热带农业科学院儋州市农场5队温室大棚中进行。在直径为12 cm的塑料盆中装入700 g基质，将长势均匀的健康幼苗（辣椒选用 5～6叶期幼苗，黄瓜、番茄、西瓜选用两叶一芯期）移栽到盆中。试验组处理如下：将经过浅盘固体发酵并干燥后的棘孢木霉DQ-1孢子粉（1.5×1010CFU/g）稀释1500倍，制成浓度为1×107CFU/g的孢子悬浮液，幼苗移栽后浇足底水，于第2、7 d各灌100 mL孢子悬浮液，同时在第7 d用稀释液进行一次叶面喷雾处理。试验第15 d时测量植株的株高、根长、地上部分鲜重及根的干重和鲜重。以清水处理作对照，每处理50株，3次重复。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。采用Duncan法进行方差分析和多重比较（P＝0.05），利用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同固体发酵基质对产孢量的影响

5种固体发酵基质在发酵5 d时产孢量有明显差异。产孢量最高的基质是麦麸，分生孢子含量达到了1.51×109CFU/g，显著高于其他发酵基质，其次是稻壳，产孢量为1.24×109CFU/g，玉米碎粉的产孢量为6.96×108CFU/g，甘蔗渣和水稻秸秆的产孢量最低，分别为1.36×108和9.3×107CFU/g（图1）。麦麸与稻壳均有较好的营养物质，且通气性较好，所以产孢量最高。玉米粉的营养最为丰富，但是加水后会揉成团，影响内部空气流通，产孢量较低；甘蔗渣和水稻秸秆营养不够充分，产孢较少。因此选择麦麸、稻壳及玉米粉并按照一定的配比作为复合发酵基质。

图1 不同固体发酵基质下棘孢木霉DQ-1产孢量Fig.1 Spores quantity of T.asperellum DQ-1 on different solid fermentation substrate

2.2 固体发酵基质正交试验

3种固体基质麦麸、玉米碎粉、稻壳与硅藻土按不同的比例复配后发酵，通过正交试验发现麦麸:玉米碎粉:稻壳:硅藻土＝5.8:0.5:1.7:1.0（E组）比例的固体复配基质发酵时，其产孢量最高，可达 2.63×109CFU/g；其次是麦麸:玉米碎粉:稻壳:硅藻土＝5.8:1.0:0.7:1.5（D组)，产孢量为2.61×109CFU/g（图2）。

图2 不同废弃物发酵基质在不同配比情况下棘孢木霉DQ-1产孢量Fig.2 Spores quantity of T.asperellum DQ-1 in different fermentation media

2.3 不同接种方式、接种量及发酵时间对棘孢木霉DQ-1产孢量的影响

不同接种方式、接种量、发酵时间的固体发酵试验结果表明，液体接种量为2%时，产孢效果最好。在培养20 d的时间里，随着时间的增加，棘孢木霉DQ-1产孢量呈先增加后降低、最后稳定的变化趋势；在第12 d产孢量达到最高，为7.18×109CFU/g，第14 d开始其孢子含量趋于稳定。在固体接种中，4%的接种量且在第8 d产孢量达到顶峰，为5.30×109CFU/g，所需时间更短，但最大产孢量却明显降低，仅占液体接种方式的73.8%（图3）。

图3 不同接种方式、接种量及培养时间情况下棘孢木霉DQ-1产孢量Fig.3 Spore quantity of T.asperellum DQ-1 under different inoculation methods, inoculation amount and culture time

2.4 水稻秸秆替代稻壳复配发酵对产孢量的影响

经过不同处理之后的水稻秸秆作为复配发酵基质的结果显示，当用1、2和3 cm长度的秸秆代替稻壳进行固体发酵时，其分生孢子量分别为6.07×109、5.83×109和5.33×109CFU/g，产孢量均显著低于对照组。由此可以看出，产孢量随着秸秆变短而逐渐增加，当把秸秆粉碎后作为发酵基质时，孢子含量为8.60×109CFU/g，产孢量显著高于对照组（图4）。

图4 以经过不同处理的秸秆作为基质情况下棘孢木霉DQ-1产孢量Fig.4 Spore quantity of T.asperellum DQ-1 with different treated straw as substrate

2.5 浅盘发酵扩大培养及分生孢子粉的制备

在优化基质配比、接种方式、接种量、培养时间的基础上进行浅盘固体发酵，将基质装入浅盘中开始发酵（图5A、B），待其生长2 d后菌丝形成（图5C），在培养过程中保湿并翻动散热，12 d后发酵完成，将其产物自然晾干（图5D）粉碎过筛（图5E），棘孢木霉DQ-1分生孢子粉达1.50×1010CFU/g。

图5 棘孢木霉DQ-1浅盘固体发酵过程Fig.5 Solid fermentation process of T.asperellum DQ-1 in shallow plate

2.6 棘孢木霉DQ-1分生孢子粉对黄瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗生长的影响

棘孢木霉DQ-1发酵孢子粉配制的悬浮液对4种作物幼苗的处理中，在番茄幼苗上施用DQ-1分生孢子粉效果尤为突出，其株高、根长、地上鲜重、根鲜重和干重都与对照之间存在显著差异，增长率分别为14.66%、27.26%、42.23%、242.86%和51.77%；其次在黄瓜上施用DQ-1分生孢子粉效果也较好，除了根长方面不存在显著差异外，其余株高、地上部分鲜重、根鲜重和干重4项指标相比于对照均有显著的增长，增长率分别为30.13%、27.53%、88.70%和33.96%；对于辣椒幼苗，施用DQ-1分生孢子粉对辣椒根长增长显著，增长率为 14.86%，其余各项生理指标有一定的提高，但增长效果不明显；西瓜幼苗施用 DQ-1分生孢子粉后，其根长比对照减少了11.22%，是本试验中施用DQ-1分生孢子粉后唯一带来负面影响的生理指标，但其地上部分鲜重和根干重两项指标与对照相比有明显增长，增长率分别为97.47%和41.86%。综合评估，棘孢木霉DQ-1对4种作物幼苗存在明显的促进生长效果，在番茄上的表现效果尤为突出，且对于番茄的根部鲜重存在接近于3.5倍的增重效果。在洗根时发现，大部分施用棘孢木霉DQ-1的作物根系更加发达，数量更多，此外，作物的茎有明显的增粗，叶片呈现更加健康的深绿色。因此，棘孢木霉DQ-1分生孢子粉作为生物制剂应用在4种作物幼苗上，能够促进作物生长（表2，图6）。

图6 棘孢木霉DQ-1对4种作物幼苗的促生效果Fig.6 Growth promoting effect of T.asperellum DQ-1 on four crop seedlings

表2 棘孢木霉DQ-1对4种作物形态学指标的影响Table 2 Effects of T.asperellum DQ-1 on morphological indexes of four crops

3 讨论

在对单一因素发酵时发现麦麸产量最高，研究发现麦麸富含纤维素、半纤维素以及蛋白质、脂肪、低聚糖等成分，且发酵后粗蛋白、粗纤维等含量均有显著提高，能为木霉提供较多的营养供应[13,14]。但麦麸成本较高，且在含水量较高时通气性较差。因此国内大部分木霉的固体发酵基质多为麸皮、秸秆等农业废弃物与营养元素混合。如宋晓妍等[15]用麸皮和玉米秸粉混合对木霉进行发酵，靖德兵等[16]利用稻草粉、麸皮、硫酸铵混合进行康氏木霉发酵，罗洋等[17]用桔皮和麦麸混合进行里氏木霉发酵。

固态发酵一般由两部分原料构成，一种是如麸皮、豆粕、无机盐等供给养分的营养料，另一种是如稻壳、玉米皮、花生皮等促进通风的填充料[18]。本研究将麦麸、玉米碎粉、稻壳与硅藻土混合，保证了其营养和通气，并通过正交试验得到产孢量最优的发酵配比5.8:0.5:1.7:1.0，第5 d产孢量为2.63×109CFU/g。

接种量和接种方式对木霉产孢量影响巨大，接种量过小不利于混匀，且会延长发酵周期，增加成本[19]。液体接种量过大时会引起溶氧不足，移入代谢废物，影响产孢[20]。本研究将接种方式、接种量、培养时间3个条件综合分析，获得最优发酵条件为液体接种2%，培养时间为12 d，最大产孢量为5.87×109CFU/g。茹水江[21]在固体碎米基质上发酵的哈茨木霉最佳接种量为4%，第8 d时产孢量达到最大，之后略有下降并趋于稳定。周莲等[22]研究的淡紫拟青霉在固体接种量为0.5%，培养7 d时产孢量最大。本研究的棘孢木霉DQ-1在液体接种过程中增大接种量至3%、4%后，其最大产量没有升高，与董海燕[23]所研究的棘孢木霉最佳接种量12.4%有较大差别，分析原因是其先单独研究接种量对产孢的影响，优化后再确定发酵时间，与本文的将接种方式、接种量、培养时间三者结合研究，以求最高产孢量的方法存在一定差别，此外，不同菌株、不同培养基质所匹配的最佳接种量、发酵时间也有不同。

我国的大部分水稻秸秆都通过焚烧、堆垛形式处理，浪费资源的同时又污染环境，因此本文将其作为微生物发酵基质进一步发掘其农业应用价值，在单一发酵基质试验中，没有将水稻秸秆粉碎，导致其产孢量较低。黄达名等[24]提到，在固态发酵中，原料粉碎得细, 可提高利用率和产量。因此本研究进一步探索了不同处理方式的秸秆替代稻壳作为复配发酵基质时对棘孢木霉DQ-1的产孢量影响。经试验发现，水稻秸秆可以代替稻壳作为木霉菌的固体发酵基质，粉碎后的秸秆产孢量显著高于未粉碎的秸秆，并优于稻壳。任佐华[25]对水稻秸秆多菌接种混合发酵后发现粗蛋白含量为 15.22%，超过了麦麸处理。将秸秆粉碎后，有利于棘孢木霉更充分的利用营养物质。另一方面，水稻秸秆中纤维素分子的连接键在 25 ℃下的半衰期为 500～800万年，在自然状态下极难分解[26]。利用木霉菌等微生物可有效降解秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素[27]。棘孢木霉DQ-1可较好的利用秸秆进行发酵，存在一定的生物降解能力，可进一步开发其在微生物降解方面的应用价值。

采用本研究的最优发酵基质配比和最优发酵条件，通过浅盘固体发酵并干燥粉碎后得到的棘孢木霉DQ-1纯孢子粉含量可达 1.50×1010CFU/g，最终的木霉孢子含量得到了大幅度提升。易征璇等[28]研究提到，木霉分生孢子采用浅盘法进行发酵有利于工厂化的扩大培养，且在浅盘发酵时要及时对培养基进行翻动，进行通氧和放热，发酵好的培养物尽快进行风干粉碎，便于保存。此外，若在实际生产过程中，无法测定孢含量时，也可通过发酵产物的外观判断是否终止发酵过程[29]。

采用本试验获得的木霉孢子粉通过叶面喷施和灌根应用于黄瓜、西瓜、番茄、辣椒4种作物幼苗，西瓜根长相比对照有所减少，但根系变粗，根重增加。对于西瓜作物，国内研究大多是木霉对西瓜枯萎病的防治，对于西瓜促生方面研究较少。周池卉等[30]验证了在一定程度上，哈茨木霉菌剂在西瓜上施用越多，西瓜秧苗长势越好。针对作物番茄，陆宁海等[31]和曲薇等[32]研究的哈茨木霉，孙冬梅等[33]的黄绿木霉均对番茄幼苗有良好的促生作用，其一般机理是木霉可提高作物对营养元素的吸收，提高光合作用，促进根系生长发育，本研究的棘孢木霉DQ-1同样对番茄幼苗促生长效果较明显。张春秋等[34]研究发现棘孢木霉、哈茨木霉、拟康氏木霉均可提高黄瓜叶绿素含量、株高、茎粗等指标，与本研究结果一致。赵兴丽等[35]研究的钩状木霉使辣椒的株高、根长、鲜重和干重分别增长13.5%、16.2%、43.8%和45.3%。胡琼[36]研究发现哈茨木霉与土以1:10混合，对辣椒的促生效果最为明显。本试验获得的棘孢木霉DQ-1对辣椒幼苗也有一定的促进生长效果。