固本畅枢法对肥胖糖尿病大鼠糖脂代谢及胰岛β细胞凋亡的影响*

唐咸玉，孙 璐，何 柳，曾慧妍，何嘉莉，谢雯雯，朱胜伶

(广东省中医院，广州 510120)

我国超重人群中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患病率高于美国(15.45% vs. 8%～9%)[1]，糖尿病合并肥胖存在的糖脂代谢紊乱可启动内质网应激，导致胰岛β细胞凋亡[2]，加速糖尿病的进展。改善糖脂代谢、抑制糖脂毒性诱导的内质网应激、减少β细胞凋亡可能成为防治肥胖T2DM的新途径。中医认为，此类患者的主要病机为脾肾阳虚、枢机不利、痰瘀内阻。前期临床研究证实，运用具有“温补脾肾之阳，和畅枢机”功用的固本畅枢法可改善肥胖T2DM 患者胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)，减轻其体质量及临床症状[3]。本研究复制肥胖糖尿病大鼠模型，通过体内实验了解固本畅枢法对模型大鼠糖脂代谢的影响，以及胰腺β细胞凋亡时典型的形态学改变；通过体外培养小鼠胰岛β细胞MIN6，采用流式细胞术定量分析β细胞凋亡情况。本文运用生物化学、形态学与定量分析相结合，旨在进一步研究固本畅枢法对胰岛β细胞凋亡的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物及饲养

无特定病原体动物(specific pathogen free，SPF)级成年雄性sprague-dawley(SD)大鼠，体质量140～160 g共40只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2013-0002，实验动物伦理学批准号2016054。SPF组鼠料为广东省医学实验动物中心供应(饲料合格证号0082700)。高脂高糖饲料由北京博爱港公司提供，组分包括玉米、猪油、蔗糖、胆固醇、豆粕、小麦麸、次粉、鱼粉、麻油、大豆油、磷酸氢钙、石粉、胆酸钠、赖氨酸、食盐、氯化胆碱、多种维生素及矿物元素。维持料65%+猪油10%+蔗糖20%+胆固醇2.5%+胆酸钠1%+混调剂(鸡蛋麻油花生)1.5%。

1.2 细胞及培养

小鼠胰岛β细胞MIN6(广州铭善上生物科技有限公司提供)，细胞复苏后将MIN6细胞用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、5μl/Lβ-巯基乙醇的DMEM-高糖培养基于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。

1.3 药物

固本畅枢方组成：熟附子10 g，茯苓20 g，山药20 g，干姜10 g，丹参15 g，苍术10 g，党参20 g，玄参10 g，葛根30 g，黄芪30 g，大枣15 g，柴胡10 g，黄芩6 g，法半夏10 g。药材由广东省中医院药房提供，经药剂科鉴定均为纯正药材。将中药制成粗粉，煎药取汁并过滤，置于水浴箱内浓缩成含生药2.2 g/mL的混悬液，药液常温冷却后置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.4 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(streptozocin，STZ)(sigma公司，货号S0130)；TUNEL试剂盒(Roche公司，货号11684795910)；原位荧光标记试剂盒(DAPI)(Roche公司，货号11684817910)；甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(Cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein，HDL-C)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号分别为A110-2、A111-1、A113-1、A112-1)；胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia公司，货号10-1247-01)；胎牛血清、RPMI-1640培养基、DMEM-高糖培养基、青链霉素(Hyclone，货号分别为Cat.No.SH30087.01、Cat.No.SH30809.01B、Cat.No.SH30022.01B、Cat.No. SH30010)；β-巯基乙醇(BBI公司，货号ZY60)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(keygen，货号KGA106)；96孔板细胞培养板(NEST，Cat.No.PPP-001-030)；HERACELL150i型细胞恒温培养箱(Thermo scientific)；Multiscan MK3型酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；FACSCalibur型流式细胞仪(BD)； DMI6000B型倒置荧光显微镜(Leica)；CM10 型透射电镜(Philips)；1X71型显微成像系统(日本Olympus)。

2 方法

2.1 造模、分组及干预方法

SPF级成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组(10只)及模型组(30只)，正常对照组给予普通饲料喂养，模型组给予普通饲料适应性喂养1周，再给予高糖高脂饲料喂养8周后，按30 mg/kg单次腹腔注射STZ溶液，72 h后尾静脉采血测定其空腹血糖及空腹胰岛素水平(禁食8 h以上)，糖尿病大鼠模型的确立标准是空腹血糖≥11.1 mmol/L，未成模者剔除。造模成模率为86.7%，成模后大鼠按随机数字表法分为治疗组及模型组各13只。治疗组及模型组继续给予高糖高脂饲料喂养，治疗组以18.8 g/(kg·d)剂量每日2次灌胃固本畅枢方混悬液，正常对照组和模型组灌胃等量蒸馏水，持续给药4周，所有组别均未出现大鼠死亡。

MIN6细胞分为正常组、凋亡模型组(8.3 mmol/L的葡萄糖+5 μL/Lβ-巯基乙醇+2μg/mL衣霉素培养24 h)和含药血清组(凋亡模型+10%含药血清)。

2.2 标本采集

2.2.1 血清标本采集 给药结束后各组大鼠尾静脉穿刺采血测血糖；心脏穿刺采血，离心分离血清，-80 ℃保存备用。

2.2.2 组织及细胞标本采集 各组大鼠心脏穿刺采血后处死，无菌操作取出胰腺、肝脏、大腿肌肉组织、脂肪组织，分别切取部分组织(胰腺宜取胰尾)在4%多聚甲醛液中固定4～6 h，常规石蜡包埋，待做HE染色及TUNEL、DAPI检测。MIN6细胞悬液从细胞培养板中转移到一个干净的离心管内，离心保存备用。

2.3 指标检测及方法

2.3.1 血糖、血脂及胰岛素测定 TG、TC采用GPO-PAP酶法，LDL、HDL采用直接法，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)采用葡萄糖氧化酶法，空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)采用ELISA测定，具体步骤严格按照试剂盒说明书操作。计算胰岛素敏感性指数(IAI)：IAI=1/(G0+I0)[I0为空腹血胰岛素，G0为空腹血葡萄糖]。

2.3.2 胰腺、肝脏、大腿肌肉及脂肪组织的病理变化 石蜡包埋的组织切取5 μm 厚的切片，将切片进行HE 染色，用光学显微镜观察以上4种组织的病理变化并摄片。每组选3只大鼠，分别取胰脏、肝脏、大腿肌肉组织、脂肪组织，切至0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小，固定于2.5%戊二醛液中，经PBS 漂洗、丙酮梯度脱水、Epon812包埋后，LKB超薄切片机切片，透射电镜下观察细胞超微结构的变化并摄片。

2.3.3 TUNEL-DAPI共染色法检测胰腺细胞的凋亡 TUNEL染色法：将石腊包埋的胰腺组织切片进行脱腊、水化，PBS漂洗，蛋白酶K(1∶10 PBS 稀释)37 ℃孵育10～20 min后PBS漂洗2次，甩干(擦干)组织周边，检测样本和阳性对照样本，加入TUNEL reaction mixture 50μL，阴性对照样本加入Label Solution，37 ℃湿盒避光孵育60 min，PBS漂洗3次，封闭内源性过氧化物酶活性，在脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidy transferas, TDT)与荧光素连接的核苷酸混合缓冲液内孵育，NBT-BCIP显色。阴性对照不加TDT。阳性细胞呈现蓝色荧光。

DAPI染色法：用中性树胶圈定组织片的界限，加入200 μL RNase A，37 ℃避光作用30 min，滴加300μL PBS，滴加60μL DAPI饱和工作液摇匀，室温下避光作用10 min弃染液，PBS洗涤3次，封片后荧光显微镜下观察(设置为WB滤色孔)并照相。结果判断：健康细胞的细胞核体积较大，发散均匀、微弱的淡绿色荧光；凋亡细胞的细胞核缩小、致密，发散高亮的绿色荧光。

光镜下观察和摄片，每组选10张，每张切片选20个视野，计算每20个放大100倍视野里胰腺凋亡阳性细胞数，分组汇总后计算其平均数。

2.3.4 MTS法检测MIN6细胞增殖 消化细胞后吹打散细胞计数，调整细胞浓度1×105个/mL，分到96孔板，每孔100μL，即每孔细胞为1×104个。贴壁细胞需待细胞贴壁后收集各个时间点的细胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入cell Titer96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega，Cat.No.G3582)，比例为1/10，即100 μL培养液加入10 μL检测液。孵育4 h后酶标仪读板，MTS检测读取OD490数据。

2.3.5 流式细胞术检测MIN6细胞凋亡 将细胞培养板各组的培养基分别转移到15 mL 的锥形管中并置于冰上，用2 mL PBS 溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS 溶液，加入0.5 ml 0.25%胰酶不含EDTA孵育，直到显微镜下观察到细胞开始从培养板壁脱落，轻轻连续拍打使细胞从培养板壁上完全脱落，将细胞重悬于预冷的1×结合缓冲液中使其密度大约为1×106细胞/ml，将0.5 mL 细胞悬液从细胞培养板中(5×105个细胞)转移到一个干净的离心管内，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室温(18～24°C)避光反应15 min，室温1000×g 离心5 min，去除上清，将细胞用0.5 mL 预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬，加入10 μL Propidium Iodide，将样本放置在冰上避光保存，立即用流式细胞仪检测分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 治疗后各组大鼠一般情况比较

表1示，正常组大鼠毛发自然有光泽，行动正常，无多饮、多食及多尿。糖尿病模型组大鼠毛发晦暗粗糙，行动偏迟缓，有多饮、多食、多尿症状。治疗组大鼠上述症状有一定改善，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠治疗后饮水、摄食及尿量水平比较

3.2 治疗后各组大鼠血清FBG，FINS及IAI比较

表2示，模型组与正常组比较，FBG与FINS水平均升高(P<0.01)，IAI水平下降(P<0.01)；治疗组与模型组比较，FBG与FINS水平均下降(P<0.01)，IAI水平升高(P<0.01)，差异均有统计学意义。

表2 治疗后各组大鼠FBG、FINS、IAI水平比较

3.3 治疗后各组大鼠血脂水平比较

表3示，模型组与正常组比较，TG与TC水平均升高(0.05，P<0.01)，HDL水平下降(P<0.01)，LDL水平也有下降，但与正常组比较差异无统计学意义；治疗组与模型组比较，HDL水平明显升高(P<0.01)，其余指标也有所改善，但差异无统计学意义。

表3 治疗后各组大鼠血脂水平比较

3.4 各组大鼠病理检测结果比较

3.4.1 各组大鼠胰腺组织病理比较 正常组大鼠胰岛呈椭圆形，细胞形态饱满，排列紧密，边界清晰，结构规则，胞浆充实饱满。模型组大鼠胰岛萎缩，形态不规则，边界不清晰，结构紊乱，胞浆疏松，有的存在空泡。治疗组大鼠胰岛形态基本规则，胰岛与外分泌部界限较清晰，胞浆少量空泡(见图1)。

注：A.正常组；B.糖尿病；模型组；C.治疗组(箭头所示为模型组典型改变)图1 各组大鼠胰腺组织病理学结果比较(HE染色×40)

3.4.2 各组大鼠肝脏组织病理比较 正常组大鼠肝脏组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞形态正常，肝索排列均匀规则，无坏死。糖尿病模型组大鼠肝小叶变形，界限不清晰，肝索排列紊乱，肝细胞肿胀变形，大小不均匀，可见局部坏死，细胞质中见大小不等的脂肪空泡。治疗组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞形态基本正常，大小基本均匀，细胞质中脂肪空泡减少(见图2)。

注：A.正常组；B.糖尿病；模型组；C.治疗组(箭头所示为模型组典型改变)图2 各组大鼠肝脏组织病理学结果比较(HE染色×40)

3.4.3 各组大鼠肌肉组织病理比较 正常组大鼠肌纤维排列规则，肌间隙均匀一致，无肌纤维扭曲、断裂、溶解和坏死现象。糖尿病模型组肌大鼠肌纤维排列紊乱、断裂、扭曲，肌间隙大小不一。治疗组大鼠肌纤维较模型组排列规则，无明显断裂扭曲，肌间隙均匀(见图3)。

注：A.正常组；B.糖尿病模型组；C.治疗组(箭头所示为模型组典型改变)图3 各组大鼠肌肉组织病理学结果比较(HE染色×40)

3.4.4 各组大鼠脂肪组织病理比较 正常组大鼠脂肪细胞结构清晰、分界清楚呈蜂窝状。糖尿病模型组大鼠脂肪细胞体积明显增大，轮廓变形。治疗组大鼠脂肪组织细胞体积较模型组减小，轮廓清晰(见图4)。

注：A.正常组；B.糖尿病模型组；C.治疗组(箭头所示为模型组典型改变)图4 各组大鼠脂肪组织病理学结果比较(HE染色×40)

3.5 各组大鼠胰腺β细胞凋亡比较

细胞在发生凋亡时会激活一些DNA内切酶，DNA断裂暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的dUTP，TUNEL检测呈现蓝色[4-6]。凋亡细胞的细胞核在DAPI检测中呈现高亮的绿色荧光。

表4图5示，正常组、模型组、治疗组均有蓝色荧光，表明实验结果有效。与正常组比较，糖尿病模型组蓝色荧光区域明显增加，并可见绿色散在荧光，TUNEL、TUNEL/DAPI值显著升高(P<0.01)，提示胰腺β细胞凋亡增加；治疗组蓝色荧光较糖尿病模型组减少，偶见绿色荧光，TUNEL、TUNEL/DAPI值低于模型组(P<0.01)，差异有统计学意义，表明固本畅枢方能有效抑制糖尿病模型大鼠胰腺β细胞的凋亡。

表4 治疗后各组大鼠胰腺TUNEL/DAPI检测结果比较

注：A.正常组；B.糖尿病；模型组；C.治疗组(箭头所示为凋亡细胞)图5 TUNEL染色与DAPI染色重叠拍照(40×10)

3.6 各组MIN6细胞增殖比较

图6示，细胞形态观察显示，凋亡模型组细胞数量明显减少，细胞体积变小，细胞间隙增大，细胞核固缩；含药血清组(干预48 h)细胞形态较模型组有不同程度的改善。图7示，MTS法检测细胞增殖，0 h各组MIN6细胞药物敏感性无差异，干预12 h、24 h、48 h后，凋亡模型组MIN6细胞药物敏感性明显下降，含药血清组在24 h、48 h有不同程度上升。

注：A.正常组；B.凋亡模型组；C.含药血清组(箭头所示为凋亡细胞)图6 各组MIN6细胞干预48 h形态学观察比较(10×10)

图7 MIN6细胞药物敏感性MTS检测

3.7 各组MIN6细胞凋亡比较

Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行绿色荧光(fluorescein isothioc yanate, FITC)标记，以标记的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一种核酸染料，不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但对凋亡中晚期细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜染红细胞核。因此将Annexin V与PI匹配使用，可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

图8示，在双变量流式细胞仪的散点图上，Q4象限显示活细胞，Q3象限为早期凋亡细胞，Q2象限为凋亡晚期细胞和坏死细胞。结果提示，模型组Q2+Q3象限细胞数显著升高，含药血清干预组Q2+Q3象限细胞数较模型组少(29 vs. 14.05)，提示固本畅枢方含药血清可以改善MIN6细胞早期及晚期凋亡。

注：A.正常组；B.凋亡模型组；C.含药血清组(箭头所示为凋亡细胞象限)图8 各组MIN6细胞凋亡比较

4 讨论

糖尿病属于中医学“消渴”范畴。既往课题组经过长期临床实践发现，脾肾阳气虚损在糖尿病发病过程中有重要作用，即阳气易虚、阳虚致消、枢机不利、阳气失用、痰饮、瘀血等病理产物亦是由于正虚、阳气的运行障碍所致[4]。因此，从正气亏虚、脾肾阳(气)不足在疾病发生发展中所起的主导作用入手，提出阳虚枢机不利为肥胖2型糖尿病的基本病机。治疗以固本畅枢为法，方拟茯苓四逆汤、施今墨降糖对药方合小柴胡汤加减进行临床研究，组方中附子、干姜、黄芪温肾助阳，重在激发先天之原动力，使其蒸腾气化津液到达全身脏腑组织；葛根、黄芩生津止渴，口干口渴诸症缓解以免精微物质外流；党参、茯苓、山药、大枣、苍术健脾益气，培补后天之本，使水谷精微得以四布、脏腑得养、湿浊得化、精微得布；法半夏、丹参、柴胡枢畅气机，运血周流全身，以免瘀血形成。前期研究显示，固本畅枢方能降低肥胖糖尿病患者血糖血脂，改善IR，减轻口干、多饮、多尿及乏力等临床症状[3]。组方的主要中药药理学研究发现，黄芪化合物可以改善胰岛素抵抗，减轻糖耐量异常[5-6]；葛根中的葛根素能通过提高葡萄糖的利用率，改善葡萄糖耐量并降低血糖[7-8]；山药多糖能显著降低2型糖尿病大鼠空腹血糖，其降血糖作用与二甲双胍相当[9]；茯苓粗提物具有类似于二甲双胍改善外周胰岛素抵抗的作用[10]；丹参可以降低糖尿病模型大鼠血糖水平[11]，其有效成分丹酚酸A以剂量依赖的方式增加葡萄糖的消耗和摄取[12]。中药复方相互协同，以不同方式发挥降糖作用。

研究表明，T2DM患者体内的胰岛β细胞损伤呈进行性加重，这可能与糖脂代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等有关[13-14]。胰岛β细胞凋亡过多会造成胰岛β细胞功能障碍，因此改善T2DM患者体内糖脂代谢环境、抑制胰岛β细胞凋亡对防治2型糖尿病有重要意义。临床实践中暂未发现可以同时改善糖脂代谢紊乱及胰岛β细胞凋亡的药物，所以本研究未设阳性对照药物组。本研究提示，糖脂代谢紊乱肥胖大鼠模型可通过长期高脂高糖饮食+小剂量STZ腹腔注射诱导成功，长期高脂高糖饮食可导致大鼠体质量增加、胰岛素抵抗及糖耐量减低，小剂量STZ可引起胰岛β细胞破坏，其病理生理改变符合肥胖2型糖尿病的胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能缺陷两大特点[15]。糖尿病模型组大鼠的饮水、摄食、尿量明显增加，伴随高血糖、高脂血症、空腹胰岛素水平升高，胰岛素敏感性下降，而经固本畅枢法治疗后以上症状均能得到不同程度改善，体现了该治法降低血糖血脂、改善胰岛素抵抗的综合调节作用。组织HE染色观察提示，治疗组大鼠的组织病理学表现得到一定程度的修复，有利于胰岛β细胞功能恢复，进一步促进胰岛素分泌，减少肝糖原的输出，增加肌肉、脂肪组织对胰岛素的敏感性，从而起到降低血糖的作用。

细胞凋亡是一种活跃的细胞死亡模式，在多细胞生物的发育过程中发挥着重要作用[16]。大量的DNA双链断裂被认为是凋亡中最显著的特征[17]。但是TUNEL染色的局限使凋亡细胞和坏死细胞无法区分，其特异性降低，假阳性增加。故结合DAPI染色能准确反映细胞核中的DNA断裂及染色定位，阳性细胞和阴性细胞对比颜色鲜明，容易辨认[18]。本研究发现，糖尿病模型组可见明亮的蓝色及绿色荧光，TUNEL、TUNEL/DAPI值显著升高，提示胰腺β细胞凋亡增加；治疗组蓝色荧光比糖尿病模型组少，偶见绿色荧光，TUNEL、TUNEL/DAPI值低于模型组，提示固本畅枢方能有效抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞的凋亡。体外实验结果提示，固本畅枢方含药血清可以改善MIN6细胞凋亡模型组的细胞形态，干预24 h及48 h后含药血清组MIN6细胞的敏感性有所提升；流式细胞术检测提示，固本畅枢方含药血清能够减少MIN6细胞凋亡模型的早晚期凋亡细胞及坏死细胞的数量。本研究应用2种方法相结合检测细胞凋亡，其结果更准确。

综上，固本畅枢法能够改善肥胖糖尿病模型大鼠糖脂代谢紊乱，其作用机制与修复胰腺、肝脏、肌肉及脂肪组织的病理形态、抑制胰岛β细胞凋亡有关。