血清miR-146a水平与小儿支气管哮喘发作期中医证型的相关性分析*

李香玉，周 旋，陈莉丽

(长春中医药大学附属医院， 长春 130000)

支气管哮喘简称哮喘，是儿科常见呼吸系统慢性炎症性疾病，临床主要表现为喘息、胸闷、呼吸困难等症状[1-2]。有研究报道，全世界哮喘发病人数不断升高，尤以婴幼儿的发病率常年居高不下，其长期反复发作的特点给家庭带来诸多方面负担[3]。中医认为，哮喘急性发作病因为肺中伏痰、气道受阻、咳嗽多痰故而生喘，其中以风寒、风热为主引发哮喘反复发作，久病不愈常导致肾阳虚弱，因此有中医学家将小儿哮喘发作期哮喘按寒热虚实辨证。如马融教授[4]根据中医辨证分型将发作期哮喘分为寒哮型、热哮型、外寒内热型、虚实夹杂型。中医多从宏观角度对哮喘进行辨证论证，现代医学多从实验检测方面入手，二者相结合对临床更有指导意义。

目前大量研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)在哮喘发病机制中发挥着重要作用。已有研究发现，微小RNA-146a(miR-146a)与类风湿关节炎中医证型有关[5]，miR-146a基因多态性与儿童哮喘易感性密切相关[6]。但未见关于血清miR-146a表达与小儿哮喘中医证型关系的研究报道。因此，本研究旨在分析血清miR-146a水平与小儿哮喘中医证型的关系，为其治疗及机制研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年3月至2019年3月长春中医药大学附属医院儿科收治的130例哮喘发作期患儿进行研究(即哮喘组)，选取同期130例体检健康儿童作为对照组。最终纳入哮喘组男76例，女54例；年龄3～12岁，平均年龄(7.56±2.18)岁；对照组男79例，女51例；年龄3～14岁，平均年龄(8.02±2.35)岁。2组受试儿童性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经长春中医药大学附属医院伦理委员会批准(批准文号20161218)。

1.2 诊断标准

哮喘组诊断依据儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)中的诊断标准制定[7]。

1.3 辨证分型标准

中医辨证分型参考《中医儿科学》制定辨证标准，将哮喘组患儿分为热哮型、外寒内热型、寒哮型、虚实夹杂型4种类型[4]。

1.4 纳入标准

符合哮喘发作期中西医诊断标准[7]；符合中医辨证分型标准[4]；年龄<14岁；监护人知情并签署知情同意书。

1.5 排除标准

哮喘缓解期者；由纵膈肿瘤、心源性疾病继发的哮喘者；伴肺心病、呼吸衰竭者；伴心血管、肝、肾等严重疾病者；伴造血系统障碍疾病者；合并呼吸道传染病者；依从性差者；精神失常患儿。

1.6 样本收集

所有受试儿童抽取清晨空腹肘静脉血3 mL，室温静止25 min，2800 r/min离心20 min，分离上清，超低温冻存待检。

1.7 主要试剂与仪器

miR-146a、U6引物由美国Invitrogen公司设计并合成。mir VanaTMPARISTMKit试剂盒(Ambion，货号AM1556)；Taq Man®Micro RNA Reverse(美国Life Technologies公司，货号80284)；Transcription Kit(上海熹垣生物科技有限公司，货号XY-JBS-PCR-519XS)；Taqman®Universal Master Mix II(上海恒斐生物科技有限公司，货号444-0040)；Taq Man®Micro RNAAssay试剂盒(ABI，货号403061)；总IgE试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司，货号JK-(a)-1665)；人白介素6 ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，货号70-EK106/2-96)；人嗜酸性粒细胞检测试剂盒(上海沪震实业有限公司，货号hz-H2341c)；分光光度计(Eppen dorf，型号Biophotometer)；普通PCR仪(Bio-Rad，型号T100)；G-3000荧光定量PCR仪(Corbett Research，型号Rotor-Gene 3000 A)。

1.8 观察指标与方法

1.8.1 血清miR-146a检测 采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-146a表达。miR-146a引物序列：上游引物：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3’，下游引物：5’-CCTCGAGT}CATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3’，内参U6：上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；总RNA提取、纯化，逆转录合成cDNA，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5min，以U6为内参进行PCR扩增，反应条件：50 ℃ 2min 1个循环，95 ℃ 10 min 1个循环，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 40个循环，具体实验步骤参照试剂盒说明书操作，采用2-ΔΔCT方法计算血清miR-146a相对表达量。

1.8.2 病情控制评估 采用哮喘控制测试(asthma control test，ACT)评分[8]评估病情，患儿与家属共同填写ACT表，共包括7个问题，前4个问题为0～3分，由患儿独立完成，后3个问题0～5分，由家属完成，总分25分，分数越高说明患儿病情控制越好。

1.8.3 血清指标检测 采用酶联免疫法使用相应的试剂盒检测受试者血清白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、总免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)、嗜酸性粒细胞水平。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 130例哮喘患儿中医证型分布情况

收治的130例哮喘发作期患儿中，热哮型58例(44.62%)，外寒内热型40例(30.77%)，寒哮型患儿32例(24.61%)，虚实夹杂型0例，以热哮型、外寒内热型、寒哮型常见。

2.2 2组受试儿血清miR-146a表达及相关炎症因子水平比较

表1示，哮喘组患儿血清miR-146a表达、IL-6、总IgE、嗜酸性粒细胞水平明显高于对照组(P<0.05)。

表1 2组受试儿血清miR-146a及炎症因子表达比较

2.3 不同中医证型哮喘患儿血清miR-146a水平比较

表2示，寒哮型、外寒内热型患儿血清miR-146a表达均显著高于热哮型(P<0.05)，寒哮型血清miR-146a表达高于外寒内热型(P<0.05)。

表2 不同中医证型哮喘患儿血清miR-146a表达比较

2.4 不同中医证型哮喘患儿血清相关炎症因子水平比较

表3示，寒哮型、外寒内热型患儿血清IL-6、总IgE、嗜酸性粒细胞水平均显著高于热哮型(P<0.05)，寒哮型血清IL-6、总IgE、嗜酸性粒细胞水平高于外寒内热型(P<0.05)。

表3 不同中医证型哮喘患儿血清相关炎症因子水平比较

2.5 不同中医证型哮喘患儿ACT评分比较

表4示，寒哮型、外寒内热型患儿ACT评分明显低于热哮型(P<0.05)，寒哮型低于外寒内热型(P<0.05)。

表4 不同中医证型哮喘患儿ACT评分比较(分，

2.6 不同中医证型患儿血清miR-146a表达与ACT评分关系

图1～3示，寒哮型患儿血清miR-146a表达量与ACT评分呈正相关(r=0.700，P=0.000)；外寒内热型患儿血清miR-146a表达量与ACT评分呈正相关(r=0.591，P=0.000)；热哮型患儿血清miR-146a表达量与ACT评分呈正相关(r=0.488，P=0.005)。

图1 寒哮型患儿血清miR-146a表达与ACT评分相关性

图2 外寒内热型患儿血清miR-146a表达与ACT评分相关性

图3 热哮型患儿血清miR-146a表达与ACT评分相关性

3 讨论

哮喘属于中医学“喘鸣”“喘息”“呷嗽”“喘咳”范畴。《素问·阴阳别论篇》有云：“阴争于内……起则熏肺，使人喘鸣。”《诸病源候论·上气喉中如水鸡鸣候》曰：“肺病令人上气……喘息不调，致咽喉……如水鸡之鸣也。”元·王执中《针灸资生经·喘》中首现“哮喘”之名。近代医家对小儿哮喘发作期辨证分型存在诸多不同观点。廖芳菊等[9]主张按“寒性哮喘、热性哮喘、外寒里热”3个证型对急性发作期哮喘患儿进行辨证治疗，疗效较好。本研究结果显示，收治的130例哮喘发作期患儿中，热哮型58例(44.62%)，外寒内热型40例(30.77%)，寒哮型32例(24.61%)，与上述研究结果相似，提示小儿哮喘发作期以热哮、外寒内热、寒哮多见。哮喘发作期患儿存在免疫调节失衡现象。目前认为，Th1/Th2失衡是哮喘发病的重要机制，平衡向Th2迁移，Th2型细胞因子增多进而会加重气道炎症，导致哮喘急性发作[10]。当外界过敏原进入机体后，过敏原与IgE抗体结合，引起肥大细胞活化，分泌活性介质，导致气道炎症。穆清爽等[11]发现，哮喘患者中血清IL-6、嗜酸性粒细胞、总IgE水平高于健康者。本研究发现，哮喘患儿血清IL-6、嗜酸性粒细胞、总IgE水平高于健康儿童，且寒哮型、外寒内热型、热哮型患儿血清IL-6、总IgE、嗜酸性粒细胞水平依次降低，提示哮喘患儿发病可能与气道炎症相关，且不同证型哮喘患儿气道炎症程度不同。

miRNA是非编码小RNA，大量研究证实miRNA表达异常与哮喘的发生发展密切相关[12]。穆清爽等[13]研究发现，miRNA-126在哮喘急性加重期患者血浆中低表达，并能通过调节Th2优势转化提高IL-6、嗜酸性粒细胞及IgE水平，加重患者炎症反应，促进病情发展。miR-146a在多种疾病中异常表达，有研究报道其表达与气道炎症性疾病相关。而miR-146a高表达可抑制Th1分化，促进Th2分化白细胞介素-4等促炎因子表达，参与炎症反应[14-15]。Comer等[16]发现，miR-146a在哮喘患者气道平滑肌细胞中表达水平上调，且miR-146a能间接调控IL-6、IL-8等炎性细胞因子，并不抑制IL-6、IL-8因子产生。Zhang等[17]研究发现，miR-146a在哮喘患儿血浆中表达升高，miR-146a过表达可下调其靶基因表皮生长因子受体进而抑制支气管平滑肌细胞增殖，促进其凋亡。本研究结果显示，哮喘组患儿血清miR-146a表达高于对照组，与上述研究结果相似，提示miR-146a可能与其致病机制相关。黄永莲等[18]发现，哮喘虚证肺气虚证型、肺脾两虚证型、肺肾两虚证型患者病情依次加重，肺功能随着病情加重逐渐降低。吴志洪等[19]发现，miR-146a在不同证型特应性皮炎患者皮损标本中有显著差异。本研究进一步发现，热哮型、外寒内热型、寒哮型患儿血清miR-146a表达依次升高，提示血清miR-146a表达与哮喘发作期不同中医证型有关。通过血清miR-146a检测，可能有助于小儿哮喘发作期中医分型。寒哮型哮喘为外寒邪侵入、内寒痰伏肺俞、痰阻气道、肺气上逆而致，而儿童肺、脾、肾三脏功能不足可致脾胃虚寒，加重患儿病情，其病情加重可能促进血清miR-146a表达，具体机制还需进一步研究。对不同中医证型患儿ACT评分研究发现，寒哮型、外寒内热型患儿ACT评分低于热哮型，寒哮型低于外寒内热型，提示寒哮型、外寒内热型哮喘发作期患儿病情控制较差。最后研究结果显示，寒哮型、外寒内热型、热哮型患儿miR-146a表达与ACT评分均呈正相关，提示哮喘发作期不同中医证型患儿血清miR-146a表达越高病情控制越差。

综上所述，本研究发现哮喘发作期患儿血清miR-146a高表达，miR-146a在不同中医证型哮喘患儿血清中表达量有明显差异，临床进行血清miR-146a检测可能有利于小儿哮喘中医分型。本研究对象较少，仅对哮喘发作期患儿进行研究，缺乏对哮喘持续期、缓解期患儿的研究结果，还需开展大样本量、多证型研究，以提高研究的准确性。