兰州百合不同连作年限土壤中化感物质的检测及其自毒效应的研究

黄钰芳，张恩和，张新慧，曹 瑞，谢田朋，陈红刚，高素芳

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；3.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004)

兰州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)川百合的变种，具有400多年的栽培历史。因鳞茎洁白、肉质甜美，享有“蔬菜人参”的美誉[1]。兰州百合产业是兰州市南郊二阴山区经济发展、农民创收的主要产业。但是近年来，连作重茬现象严重，已造成兰州百合产量和品质的大幅下降，连作障碍问题日渐凸显，已严重影响到兰州百合产业的持续性发展[2-4]。

连作障碍的发生是作物-土壤系统内多种因素相互关联、综合作用的结果。土壤养分失衡、土壤盐渍化和酸化、土壤酶活性的变化均能导致连作障碍[5]。除此之外，植物根系分泌物及残体分解物所引起的自毒作用也是导致连作障碍发生的重要原因。自毒效应在许多作物中已经得到证实[6-9]。研究显示[1,10]，自毒作用也是引起兰州百合连作障碍的重要因素之一。鉴于此，本试验动态研究了兰州百合生长旺盛期和收获期各连作年限下根际土壤中的化感物质，并利用生物活性试验对其中典型的化感物质进行了自毒效应的验证，以期进一步明确兰州百合连作障碍发生的可能性机制，并为缓解和克服连作障碍奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于甘肃省兰州市七里河区蛟龙寺村，海拔1 700 m。该地区属兰州市南郊二阴山区，大陆性半干旱气候，年平均气温5.8℃，生长期平均232 d，≥10℃的年积温为2 200℃，无霜期平均135 d，年均降水量460 mm，适合兰州百合喜温凉、喜光照、好湿润的生理特征。

1.2 试验设计和种植管理

2017年3月于海拔相同、坡度相近的阳坡选择歇地3 a(前茬作物为兰州百合)、连作2 a及连作4 a的兰州百合地块，每一地块划分3个小区作为相同处理的3个重复，每一小区面积为20 m2。以蛟龙寺兰州百合种植基地提供的兰州百合种球为受试对象，进行大田小区试验。

正茬、连作2 a和连作4 a地块土壤均为沙壤土。3种土壤中速效氮分别为：571.0、613.8 mg·kg-1和140.8 mg·kg-1，速效磷分别为：229.6，23.7 mg·kg-1和30.4 mg·kg-1，速效钾分别为：378.1、324.4 mg·kg-1和348.5 mg·kg-1，以最高值为基准，将3种土壤肥力补充至相同水平。选择包合紧密、基盘健康、大小均一的兰州百合种球进行种植，全生育期不再追肥，正常管理。

2017年8月和10月，即在兰州百合生长旺盛期和收获期，分别于不同处理地块随机挖取健康植株，抖掉根系大块土壤后，收集黏贴在根系4 mm以内的土壤，过筛后将每一处理土壤混合均匀，分别留存备用。

1.3 不同连作年限土壤浸提液的制备及GC-MS分析

称取生长旺盛期及收获期不同连作年限根际土壤各500 g，用8倍量蒸馏水振荡浸渍24 h后抽滤，滤液离心10 min，取上清液浓缩至适量，用氯仿分别萃取后，收集氯仿液，减压浓缩至0.5 mL，用于GC-MS测定。

GC-MS条件：采用黄钰芳等[11]的GC-MS条件对不同连作年限根际土壤浸提液进样分析，应用计算机检索系统将质谱数据与数据库进行匹配，得到未知物的结构类型。

利用相似系数公式，比较不同连作年限土壤中化合物的相似度。

式中，a、b、c分别为正茬、连作2 a及4 a土壤中独有的成分数目，d为共有成分数目(a、b、c代表的成分其相对含量均大于1%，d代表共有成分中至少有一个的相对含量大于1%)。

1.4 自毒物质的生物活性检测

为进一步检测被鉴定化学物质的自毒效应，利用对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的外源化合物(分别用D和A表示)，测定两物质在单施及共施条件下对兰州百合幼苗的化感自毒效应。对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246均购置于上海达瑞精细化学品有限责任公司。

1.4.1 单施时对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的自毒效应研究 结合前期试验结果，用氯仿将上述2种外源化合物溶解后各配制成浓度为0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的溶液，分别标记为D0.2和D5、A0.2和A5。生物学试验采用培养皿法。于培养皿底部垫入2层滤纸，分别精密吸取不同处理溶液10 mL，待溶剂挥干后，选取基盘健康、大小均匀的兰州百合种球，放入培养皿，每皿9粒种球。以溶剂氯仿为对照，每处理重复3次。将种植后的培养皿放入培养箱，25℃条件下培养15 d。之后，对兰州百合幼苗的各项生长指标进行测定。

1.4.2 共施时对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的互作效应研究 在单施试验的基础上，进行互作效应试验，分别用D0.2A0.2、D0.2A5、D5A0.2及D5A5表示，研究2种物质混合液对兰州百合幼苗生长的影响。试验方法同1.4.1节，在精密量取不同浓度的对苯二甲酸二辛酯溶液10 mL后，按照试验设计再分别加入相应浓度的抗氧剂2246溶液10 mL，待氯仿完全挥干后，种植兰州百合种球，培养15 d后，测定各项指标。

化感效应指数(Response index ，RI)采用Williamson的方法计算[12]：

式中，C为对照值，T为处理值。

综合化感效应(Synthesis effect，SE)为各项指标RI的平均值。RI>0、SE>0表示促进；RI<0、SE<0表示抑制；绝对值的大小表示化感作用强度。

1.5 数据分析

利用SPSS 21.0进行单因子方差分析，采用新复极差法(Duncan)进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 生长旺盛期兰州百合不同连作年限土壤中化感物质的检测

由表1可知，生长旺盛期从兰州百合正茬、连作2 a及连作4 a根际土壤中分别鉴定出11、15和19种化合物，主要包括：醇类、醛类、酯类、胺类、酚酸类及部分萜类物质，其中大部分曾被报道为自毒物质[13-15]，GC-MS色谱图见图1。对表1中各处理相对含量大于1%的组分进行相似系数计算，发现生长旺盛期各处理土壤中所含化合物的相似系数为15.38%。其中，抗氧剂2246 和对苯二甲酸二辛酯在各处理中均被检出，且二者相对含量较高。正茬、连作2 a及连作4 a土壤中，抗氧剂2246的相对含量分别为16.69%、17.82%和18.96%，对苯二甲酸二辛酯相对含量分别达到26.97%、31.29%和63.21%。综上可见，生长旺盛期兰州百合正茬、连作2 a及连作4 a土壤中自毒物质的种类差异较大，且连作年限越长，自毒物质种类及数量的差异性越大。

表1 生长旺盛期不同连作年限兰州百合土壤中的化感物质

2.2 收获期兰州百合不同连作年限土壤中化感物质的检测

表2显示，收获期兰州百合正茬、连作2 a及连作4 a根际土壤中分别存在9种、15种及17种化合物，所含化合物类别与生长旺盛期的检测结果相类似，包含了醇类、醛类、酯类和少数酚酸及萜类物质，GC-MS色谱图见图2。除正茬土壤中未检测到抗氧剂2246外，其他处理中仍存在对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246，且相对含量仍较高。与生长旺盛期相比，收获期各处理中被鉴定化合物的相似系数为12.50%，较前者下降了18.73%。综合可见，随连作年限的延长，收获期兰州百合土壤中存在的自毒物质种类同样有所增加，且各处理土壤中存在的自毒物质差异性较旺盛期增大。

表2 收获期不同连作年限兰州百合土壤中的化感物质

2.3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的自毒效应研究

2.3.1 单施时对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的自毒效应 由表3可知，2种浓度条件下，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗苗长和根长均表现出抑制作用，且5.0 mg·mL-1时抑制作用增强；对于苗鲜重和根鲜重，前者表现出“低促高抑”现象，而后者均表现出促进作用，但随浓度的升高促进作用减小。综合分析可知，在0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1条件下，同一化感物质对兰州百合幼苗的各项生长指标具有不同的化感效应；而相同浓度时，不同的化感物质对兰州百合幼苗的化感效应也存在差别。

就综合化感效应指数而言，对苯二甲酸二辛酯在0.2 mg·mL-1条件下就能抑制兰州百合幼苗的生长，而抗氧剂2246在浓度为5.0 mg·mL-1时才发挥抑制效应。

表3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗的化感效应

2.3.2 共施时对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的互作效应 为进一步深入考察化感物质间的相互作用，在固定对苯二甲酸二辛酯浓度后，配合不同浓度的抗氧剂2246，进行化感物质间的互作效应试验(表4)。

表4 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗的化感效应

对表4和表3的SE分析后可以看出，D0.2和D5的SE为负值，表明D0.2和D5对兰州百合幼苗表现出抑制作用，当加入相同作用的A5后，D0.2A5和D5A5的SE仍为负值，但其绝对值并未增加，说明D0.2A5和D5A5未表现出抑制协同作用；当给D0.2和D5中加入促进作用的A0.2后，D0.2A0.2的SE为正值，但绝对值较A0.2减小，D5A0.2的SE为负值，其绝对值较D5减小，说明两成分间表现出一定的叠加效应。

综合以上结果可以看出，对苯二甲酸二辛酯(D)和抗氧剂2246(A)间存在一定的相互作用，具体表现出：若两成分单施作用方向相同，共施时没有表现出同方向的协同效应；若两成分单施作用方向相反，共施时表现出反方向的叠加效应。

3 讨论与结论

3.1 兰州百合各生育期不同连作年限土壤中自毒成分的比较

本试验结果显示，生长旺盛期兰州百合正茬、连作2 a及连作4 a根际土壤中分别存在11、15和19种化合物，收获期各处理土壤中分别存在9、15及17种成分。主要包括：醇类、醛类、酯类、胺类、酚酸类及少量萜类化合物，其中大部分曾被报道为化感自毒物质[13-15]。同一生育期不同连作年限相比，连作4 a土壤中分离得到的成分最多，连作2 a土壤次之，正茬土壤中存在的化合物最少。可见，随着连作年限的延长，兰州百合植株向土壤中分泌的次生代谢产物不断累积，从而造成连作时间越长，自毒物质的种类和数量越多。就不同生育期而言，生长旺盛期兰州百合土壤中存在的化合物较多，收获期较少。生长旺盛期植物体内代谢频繁，形成的次生代谢产物较多，从而向土壤中分泌的化合物种类和数量也有所增加；收获期植物体内代谢减弱，加之各种微生物对土壤中化合物的不断分解，造成土壤中自毒物质种类较旺盛期有所减少且差异性有所增加。

研究显示，孙鸿强[16]从兰州百合连作土壤中检测出香豆酸、乌头酸、苯甲酸和邻苯二甲酸等多种酚酸类成分，而在本试验中鉴定出的物质主要有：醇类、醛类、酯类和少量酚酸类及萜类化合物，尚未检测到诸多酚酸类物质。这可能是研究者采用的检测方法、利用的供试对象以及收集供试材料的时间和地点不同等多种因素造成的。

3.2 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246作为典型自毒物质的原因阐释

本试验中，除收获期正茬土壤外，在其余处理土壤中均鉴定出对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246，且其相对含量均较高。对苯二甲酸二辛酯与前人[17-23]检测到的苯甲酸酯类化感物质在结构和性质上存在更多的相似性，而抗氧剂2246在陈君良等[23]的研究中已证实具有化感效应。故在本试验中将二者作为兰州百合连作土壤中存在的典型自毒物质，对其单施和共存时的化感效应进行了研究。

此外，前期结合生物活性试验测定了旺盛期对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246在连作4 a土壤浸提液中的浓度贡献大小分别为1.97 mg·mL-1和0.21 mg·mL-1；收获期二者的浓度贡献分别为1.90 mg·mL-1和0.02 mg·mL-1。自毒作用的大小与溶液浓度的高低有着密切的关系，故在预试验中结合文献报道[24]设置了0.02、0.2、2.0 mg·mL-1及5.0 mg·mL-1的浓度溶液，研究了4种浓度条件下对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗生长的影响，结果发现0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的浓度溶液对兰州百合幼苗生长的影响最显著。因此，在本试验中选择了0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的浓度条件对2种成分的自毒作用进行了研究。

3.3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246自毒效应的比较

研究显示[25]，自毒物质在发挥自毒作用时具有一定的浓度效应，即自毒效应会随着自毒物质浓度的不同而呈现出不同的作用方向和作用大小。本试验结果显示，0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1条件下，对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗的生长均产生抑制作用，但5.0 mg·mL-1时抑制作用更强。与之相比，抗氧剂2246在0.2 mg·mL-1时对兰州百合幼苗表现出促进作用，而在5.0 mg·mL-1时表现出生长抑制效应。可见，不同的自毒物质具有不同的自毒效应，而同一物质在不同的浓度条件下也呈现出不同的作用方向和大小。这一结果与前人的研究结论相似[26]。

植物土壤中存在多种自毒物质，它们对同种植物表现出的自毒作用是多种成分共同体现出来的，是这些物质的复合效应[27]。因此，许多学者总是在自毒物质单独作用效应的基础上研究自毒物质间的复合效应。如母容等[28]在研究阿魏酸、对羟基苯甲酸及其混合液对土壤氮素的影响时发现，混合液对土壤氮素转化的抑制作用最强，表明阿魏酸和对羟基苯甲酸存在协同作用。姜男[29]研究发现，0.4 μmol·L-1的咖啡酸对灰菜根长表现出显著的抑制作用，但当加入抑制贡献率为0的水杨酸后，其混合液对灰菜根长的抑制率下降了97.8%，表现出水杨酸对咖啡酸的拮抗效应。本试验在研究对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的互作效应时发现，如果二者单施作用方向相同，即均能抑制兰州百合幼苗生长，共施时没有表现出抑制协同效应；而若单施作用方向相反，共施条件下表现出了反方向的叠加作用。综合以上分析可以看出，不同的自毒物质对同种植物产生的作用效果有所差异，且自毒物质间的相互作用程度和作用方向也存在差别，体现出化感自毒物质间复杂多样的作用特点。