4种龟肉酶解液的氨基酸及呈味特性比较

黄百祺，黄创成，吴巨贤*，邹琴，刘佳凡

（1.广东科贸职业学院食品与生物工程学院，广东 广州 510430；2.四会市龟灵翁水产养殖场，广东 肇庆 526200）

龟鳖养殖业是我国近年来发展迅速的新兴特种养殖业，其产值在特种养殖业中高居第二，主要分为食用型和观赏型两类。其中食用龟养殖存量较大的品种主要有中华草龟（Chinemys reevesii）、黄喉拟水龟（Mauremys mutica）、中华花龟（Ocadia sinensis）和鳄龟（Chelydra serpentina）。目前，对于这些食用龟的利用方式主要为龟壳、龟板入药，龟肉烹调食用。随着食用龟养殖规模的进一步扩大，龟肉的销售逐渐呈现出供大于求的市场局面，产业界对龟肉深加工技术的研究和产品的开发有迫切需求。

酶解技术是提升肉类产品风味和改善肉类蛋白质特性的一种有效途径。肉类经酶解后生成大量游离氨基酸和小分子肽，这些氨基酸和小肽不仅具备独特的滋味和生理功能，可作为功能性食品添加剂，而且它们在一定条件下还能与还原糖、脂类等物质反应产生肉味和烹调效果的香气，从而制备调味品[1]。因此，利用酶解工艺进行肉类的高值化加工具有良好的应用前景，受到了人们越来越多的关注。步营等[2]研究发现蓝蛤酶解液中总游离氨基酸和呈味氨基酸对风味的贡献度明显高于蓝蛤蒸煮液。张永生等[3]研究表明部分鸡肉酶解液的Maillard反应物风味醇厚感较强。薛宇航等[4]利用酶解技术制备竹节虾风味前体物质，发现酶解液海鲜味道浓郁，非常适合用作调味品基料。由于不同蛋白酶在水解方式和酶切位点上存在差异，当利用酶解技术制备肉类水解蛋白时，蛋白酶的种类对酶解产物的氨基酸组成和风味有重要影响。碱性蛋白酶是一种丝氨酸型内切蛋白酶，具有广泛的底物特异性和较强的蛋白质分解能力，已成功用于鲣鱼[5]、鲟鱼[6]、花蟹[7]、鲬鱼[8]等水产品肉类的水解。

目前，国内关于龟肉精深加工的研究仅在即食龟肉[9]、龟苓膏[10]和龟肉活性肽分离[11]等方面开展了初步的探索，对于利用酶解技术制备呈味基料的报道较少。本试验以中华草龟、黄喉拟水龟、中华花龟和鳄龟为原料，采用碱性蛋白酶对龟肉进行酶解，对酶解液中的氨基酸组成、营养价值和呈味特性进行分析对比，探讨不同龟肉酶解液的营养评价和风味特征，以期为龟肉的高值化衍生产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄喉拟水龟、中华草龟、中华花龟、鳄龟：广东省四会市龟灵翁水产养殖场；碱性蛋白酶（200 000 U/g）：重庆市全新祥盛生物制药有限公司；氨基酸混合标准溶液（2.5 mmol/L）：日本和光纯药工业株式会社。其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA2202S型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FE20型pH计：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；JYS-A960型绞肉机：九阳股份有限公司；BWS-12型精密恒温水槽：上海一恒科学仪器有限公司；X3R型高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪：日立高新技术公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原材料预处理

活龟宰杀后充分放血，取可食用部位肌肉，用绞肉机绞碎、混匀，置于-18℃冻藏，备用。

1.3.2 龟肉酶解液制备

酶解工艺参照文献[12]的方法并略作调整，工艺流程：龟肉（50 g）→肉水比 1∶5（g/mL）→均质→调 pH值（8.0）→蛋白酶酶解（酶添加量 1%，60℃，3 h）→灭酶（95 ℃，20 min）→离心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）→上清液（酶解液）→-18℃冻藏待测。中华草龟、黄喉拟水龟、中华花龟和鳄龟肉酶解液分别记为CEH、MEH、OEH和SEH。

1.3.3 氨基酸测定

总氨基酸和游离氨基酸的测定参考GB5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，采用全自动氨基酸分析仪测定。游离氨基酸味道强度值（taste activity value，TAV）是指某游离氨基酸的含量与该游离氨基酸呈味阈值的比值。

1.4 数据分析

所有测定均平行重复3次，结果以平均值±标准差表示。运用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析，Duncan法检验，p＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 4种龟肉酶解液的总氨基酸组成比较及营养评价

作为呈味基料，肉类酶解产物不仅有良好的风味感觉，还能提供一定的营养价值。营养价值主要取决于其总氨基酸（total amino acid，TAA）含量高低和必需氨基酸（essential amino acid，EAA）组成，TAA含量越高、EAA组成比例与人体氨基酸需要比例越接近，则其品质越佳。4种酶解液中总氨基酸类别及含量见表1。

由表 1可知，CEH、MEH、OEH和 SEH的总氨基酸中均检测到16种常见氨基酸（由于采用酸水解法测定，故未检测色氨酸含量），表明这4种龟肉酶解液中的氨基酸种类较丰富。CEH的TAA含量（1 844.31 mg/100 g）显著低于其他龟肉酶解液中的对应值，OEH（1 932.48 mg/100 g）和 MEH（1 916.12 mg/100 g）之间、MEH 和 SEH（1 898.18 mg/100 g）之间的TAA含量无显著差异。4种酶解液中含量和占TAA百分比最高的3种氨基酸均相同，依次为Glu、Asp和Lys，且均以MEH中的含量最高；4种酶解液中含量和百分比最低的氨基酸均为Met，这与Glu、Asp是中华草龟、中华花龟和黄喉拟水龟肉中含量最高的氨基酸、Met是第一限制氨基酸[13-14]的规律相似，表明酶解液中总氨基酸的组成与原料的氨基酸组成有一定的联系。CEH、MEH、OEH和SEH中含量大于1.0 mg/g的氨基酸分别有 7、9、8 种和 7 种，Glu、Asp、Lys、Leu、Arg和Ala是其中共有的氨基酸种类。

4种龟肉酶解液中均含有7种EAA，ΣEAA大小依次为OEH、MEH、CEH和SEH，且不同酶解液之间的差异显著。4种酶解液中总氨基酸的ΣEAA/TAA在36.83%～40.70%之间、ΣEAA/ΣNEAA 在 58.31%～68.63%之间；其中CEH、OEH的ΣEAA/TAA约为40%，ΣEAA/ΣNEAA均大于60%，符合联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的优质蛋白质标准（ΣEAA/TAA为40%，ΣEAA/ΣNEAA为60%），表明其营养价值较高。F值是评价蛋白质类产品营养价值的指标之一，其值越大蛋白质的生理功能越好。MEH（2.50）和OEH（2.51）的F值差异不显著，但均显著高于CEH（2.38）和SEH（2.45）的F值。因此，综合对比分析TAA、ΣEAA、ΣEAA/TAA和F值等指标的排序，4种龟肉酶解液营养价值大小为：OEH＞MEH＞CEH＞SEH。

2.2 4种龟肉酶解液的游离氨基酸组成比较

4种酶解液游离氨基酸类别及含量见表2。

如表2所示，4种龟肉酶解液的游离氨基酸中均检测到16种氨基酸，CEH、MEH、OEH、SEH的总游离氨基酸（total free amino acid，TFAA）含量分别为 2.191、2.551、3.394、2.610 mg/g，且不同酶解液之间的差异显著，OEH显著高于其他龟肉酶解液。4种酶解液的TFAA含量大小顺序与其TAA含量排序不完全一致，这可能是利用相同的蛋白酶制备酶解产物时，底物特性对水解效率有重要影响，由于不同龟肉蛋白质的组成和结构各异，从而导致4种龟肉酶解液总游离氨基酸含量的差异。4种龟肉酶解液中的TFAA仅占其TAA的11.88%～17.56%，推测酶解液中大部分氨基酸以可溶性蛋白质或短肽的形式存在。

从单一氨基酸上看，4种龟肉酶解液游离氨基酸中含量和占TFAA百分比最高的均为Phe，对于CEH、MEH 和 SEH，其次为 Leu、Tyr，对于 OEH，其次为 Val、Glu；含量最低的氨基酸为 Ser（CEH、MEH 和 SEH）和Pro（OEH）。4种酶解液游离氨基酸中含量最高的3种氨基酸占TFAA的总百分比在44.39%～54.23%之间，与白鲢鱼[15]、鲫鱼[16]等水产品酶解液中含量最高的几种氨基酸在TFAA中的占比规律相似。4种酶解液游离氨基酸中的疏水性氨基酸占比均大于64%，是酶解液中主要的氨基酸种类，与耿翠竹等[17]研究结果一致。16种氨基酸在每种龟肉酶解液的游离氨基酸和总氨基酸中含量和所占百分比的排序不完全一致，这可能是由于试验所用的蛋白酶对不同氨基酸的底物特异性和酶切效率不同[18]，导致酶解液中游离氨基酸的组成与总氨基酸相比发生变化。

由表2可知，OEH中的ΣEAA/TFAA值显著高于其他龟肉酶解液的对应值，MEH和SEH中的ΣEAA/TFAA值无显著差异，但均显著高于CHE中的对应值。4种酶解液游离氨基酸中的ΣEAA/TFAA和ΣEAA/ΣNEAA 分别介于 56.50%～63.64%、129.86%～175.02%之间，均高于FAO/WHO标准，且大于其龟肉蛋白质和酶解液总氨基酸中的对应值，表明经过酶解后EAA得到了有效释放，更有利于人体吸收和利用。

2.3 4种龟肉酶解液的游离氨基酸呈味特性比较

游离氨基酸根据其呈味特性可划分为鲜味、甜味和苦味3类，其含量、比例及相互作用是影响食物风味的关键因素之一。4种酶解呈味氨基酸含量及占总游离氨基酸百分比见表3。

表3 4种酶解呈味氨基酸含量及占总游离氨基酸百分比Table 3 Content and proportion of flavor amino acid in total free amino acid in four kinds of emydidae meat enzymatic hydrolysate

如表3所示，3类呈味氨基酸含量大小对4种龟肉酶解液风味贡献的规律相似，均为苦味氨基酸最大，甜味氨基酸次之，鲜味氨基酸最小。3类呈味氨基酸含量均以OEH最高、CEH最低，且不同酶解液之间的差异显著，说明龟肉来源对其酶解产物风味影响较大。从占TFAA的百分比上看，OEH中的鲜味、甜味氨基酸及两者之和均显著高于其他酶解液，而苦味氨基酸显著低于其他酶解液。

由于不同氨基酸的味道阈值存在差异，游离氨基酸的绝对含量与其对食物风味的贡献程度不是简单的比例关系，故通过味道强度值（taste activity value，TAV）变换对4种龟肉酶解液中的呈味氨基酸进行进一步评价。结果见表4。

表4 4种龟肉酶解液呈味氨基酸的TAV值Table 4 TAV of flavor amino acid in four kinds of emydidae meat enzymatic hydrolysate

由表4可知，4种酶解液中仅有OEH中Glu的TAV大于1，这可能是由于在本试验中原料为中轻度水解，导致酶解液中游离氨基酸的含量不高所致[3]。

Glu和Asp除了能提供鲜味外，还能增加食品的甜味感觉以及滋味的厚度和持久性，由于一般食物中Glu的含量更高且阈值更低，故普遍认为其对食物鲜味的提升作用比Asp更大[19]。每种龟肉酶解液中Glu的TAV值均在所有呈味氨基酸中排列前3位，且均大于各自酶解液中Asp的TAV值，因此Glu是龟肉酶解液中的主要鲜味来源。在4种酶解液中，Glu在OEH中具有最大的TAV值，且其含量、占TFAA百分比均显著高于其他酶解液。

4种龟肉酶解液中TAV值最大的甜味氨基酸均为Ala，且明显高于其他甜味氨基酸的TAV值，是龟肉酶解液甜味的主要来源。Ala对虾、蟹等[20]水产品的鲜甜滋味有重要贡献，是一种重要的甜味氨基酸，可与Glu等鲜味氨基酸起到协同提鲜效果。4种酶解液中Ala的TAV值最大的是OEH，含量最高的是OEH且显著高于其他酶解液，占TFAA百分比最高的是MEH且显著高于其他酶解液。除了Ala外，Gly也是许多水产品酶解液中重要的甜味氨基酸[19]，一般认为其对风味的作用仅次于Glu，但本试验中4种酶解液中Gly的TAV值远小于Ala的对应值，这可能是由原料和蛋白酶特性上的差异所造成的。

4种龟肉酶解液中苦味氨基酸TAV值的排序规律有较大差异，CEH、MEH中TAV值最大的苦味氨基酸均为Phe，其次是Met和Val，OEH中为Val、Phe和Arg，而SEH中则为His、Phe和Val。4种酶解液中苦味氨基酸的TAV值均小于1，Lioe等[21]研究发现当苦味氨基酸含量低于其呈味阈值时，有增强其他氨基酸鲜味和甜味的作用。

总体上，龟肉酶解液呈味氨基酸的组成与含量与龟肉味甘、咸平的风味特性较吻合，推测龟肉酶解液的风味与其原料特性存在一定的联系。

3 结论

本试验对中华草龟、黄喉拟水龟、中华花龟和鳄龟肉碱性蛋白酶酶解液中的总氨基酸、游离氨基酸和呈味特性进行了测定和分析。结果在4种龟肉酶解液的总氨基酸和游离氨基酸中均检测到常见的16种氨基酸。4种酶解液总氨基酸中含量和百分比最高的3种氨基酸和最低的氨基酸一致，分别为Glu、Asp、Lys和Met。OEH的TAA含量、F值在4种酶解液中最高，ΣEAA/TAA和ΣEAA/NEAA值与FAO/WHO标准较接近，营养价值较高。

4种龟肉酶解液的游离氨基酸中疏水性氨基酸所占比重较大，含量和百分比最高的单个氨基酸均为Phe，总游离氨基酸含量最高为OEH。4种酶解液中游离氨基酸的ΣEAA/TFAA值和ΣEAA/NEAA值明显大于其总氨基酸中的对应值，且高于部分水产品酶解产物中的对应值。呈味特性分析显示，苦味氨基酸和甜味氨基酸对龟肉酶解液风味贡献较大，4中酶解液中OEH的鲜味、甜味氨基酸含量和百分比最高而苦味氨基酸最低。4种酶解液中仅有OEH中Glu的TAV大于1。本试验为人工养殖食用龟龟肉呈味基料的开发和高值化加工技术研究提供理论依据。