十二烷基羟丙基磺基甜菜碱对表皮葡萄球菌生物被膜的影响

石晶金，李 杰，许锦涛，吴嘉迪，官 妍

（1.上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院，上海200030；2.安徽中医药大学中西医结合学院，合肥230012；3.江苏海洋大学药学院，连云港222005）

表皮葡萄球菌是正常人体主要共生菌之一，也是附着于导管、假体、隐形眼镜、人工关节等医用生物材料上导致医院内感染的主要病原菌，其在生物材料表面所形成的生物被膜是造成相关感染治疗困难的主要原因［1］。细菌生物被膜是指细菌附着在有生命或无生命体表面，被自身分泌的胞外黏质物（Extracellular poly⁃meric substance，EPS）包裹，具有高度组织化的多细胞群体结构［2］，是细菌为了适应周围的环境而形成的一种生存方式［3］。与浮游状态的细菌相比，生物被膜状态下的细菌对抗生素抗性提高1 000～1 500 倍，对机体的免疫细胞、抗体等也都有极高的抗性［4］，单用任何一种抗生素均无法彻底杀灭生物被膜内细菌。在适宜条件下，这些存活的膜内菌又可以游离出来，在机体其他地方定植并形成新的感染灶，使感染反复迁延，给临床治疗带来困难。

表面活性剂的抑菌、杀菌作用早为人所熟知，同时它又是一种带电荷、有亲水和疏水双重功效并可改变两相性质的物质。其在医用材料的界面处可发生定向吸附，从而大幅提高抑菌效果，阻止细菌黏附和成膜。由于细菌生物被膜显示负电性，就可能与表面活性剂相互作用，影响EPS的结构和功能，从而导致生物被膜的瓦解。前期研究［5］发现，两性离子型表面活性剂——十二烷基羟丙基磺基甜菜碱（Dodecyl hydroxypro⁃pyl sulfobetaine，DSB）的抑菌（MIC 为16 mg/L）及抗细菌初始黏附效果均较为突出。DSB 因结构中同时带有羟基及阴离子和阳离子基团，不仅具有两性表面活性剂的所有优点，广泛用于家居洗涤剂的配制和制备温和的婴儿洗护用品，亦具有耐高浓度酸、碱盐，良好的乳化性、分散性和抗静电性，以及具有抑霉、杀菌性和黏弹性等。研究通过DSB对表皮葡萄球菌生物被膜内细菌代谢、对生物被膜的清除效率和对形成生物被膜的关键物质多糖胞间黏附素（Polysaccharide intercellu⁃lar adhesion，PIA）产生等作用指标的检测，去探究其对表皮葡萄球菌生物被膜的抑制和破坏作用，拓展DSB 在医疗上更多的用途，为更好地控制由表皮葡萄球菌生物被膜所引起的医院获得性感染，提供新的思路和可行方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

表皮葡萄球菌ATCC 35984（生物被膜表型和PIA表型均为阳性），复旦大学上海医学院瞿涤教授馈赠；ATCC 12228（生物被膜表型和PIA 表型均为阴性），购自中国食品药品检定研究院。

1.1.2 培养基

琼脂粉（国药集团化学试剂有限公司）；胰蛋白胨大豆琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSA、TSB，杭州微生物试剂有限公司）；刚果红培养基（刚果红0.8 g/L，脑心浸液干粉47 g/L，蔗糖36 g/L，琼脂粉20 g/L；本实验室配制）。

1.1.3 药物与试剂

万古霉素标准品（中国食品药品检定研究院）；DSB（上海银聪新材料科技有限公司），XTT（生工生物工程股份有限公司）；甲萘醌（上海笛柏生物科技有限公司）；丙酮（国药集团化学试剂有限公司）；N-（2-羟乙基）哌嗪-N-（2-乙磺酸）（无锡市亚泰联合化工有限公司）；GH 溶液：2.38 g N-（2-羟乙基）哌嗪-N-（2-乙磺酸）溶于约10 mL 水中，再加入右旋葡萄糖0.2 振荡溶解。

1.1.4 实验器材

K3 型酶标仪（LabServ）；激光共聚焦电子显微镜（Olympus IX81）；激光共聚焦显微镜专用培养皿（NEST）。

1.2 方法

1.2.1 DSB对表皮葡萄球菌生物被膜内细菌代谢的影响

以往实验测得DSB、万古霉素对ATCC 35984 的最小抑菌质量浓度（MIC）分别为16和8 mg/L［5］。

XTT 作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。通过酶标仪检测水溶性甲臜产物的吸光度，可以反映细胞中脱氢酶活性的高低，继而反映对细胞代谢的影响。当XTT 与电子耦合剂联合应用时，其所产生的水溶性甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。参照文献［6］将摇床培养过夜的ATCC 35984 以TSB 稀释至0.5 Mc（麦氏单位），取100 μL 的菌液接种入96 孔板中，37 ℃培养24 h，弃去培养基及悬浮菌，用PBS清洗3次。以TSB对倍稀释DSB、万古霉素，分别加入DSB（1 024、512、256、128、64、32、16 和8 mg/L）、万古霉素（512、256、128、64、32、16、8 和4 mg/L）（每个浓度设8 个复孔）100 μL，于37 ℃继续培养48 h。加入XTT 溶液（林格液稀释为0.5 g/L，0.22 μm 孔径的滤膜过滤除菌，临用前加VK3）100 μL，37 ℃避光培养2 h；630 nm波长处检测各孔OD值。另设空白对照组（只加培养基）、阴性对照组（未加药剂的生物被膜生长对照）。

1.2.2 DSB对PIA形成的影响

参照文献［7］用TSB分别配制DSB（16和8 mg/L）、万古霉素（8 和4 mg/L）1 mL 于试管中，均加入摇床过夜增菌的ATCC 35984（0.5 Mc）50 μL（5%的接种量）。取37 ℃培养4、8、12、16、20 和24 h 等时间段的菌液分别分区划线在刚果红培养基上［8］，37 ℃培养24 h后，室温放置24 h，观察菌落颜色。另设阳性对照（0.5 Mc ATCC 35984），阴性对照（0.5 Mc ATCC 12228）。

1.2.3 DSB对表皮葡萄球菌生物被膜清除效率的测定

在管道安装过程中，焊接出现夹渣的现象较为普遍。管道焊接过程中，存在焊接夹渣主要是由于焊接工人的技术水平偏低，焊接技术水平未能很好地满足管道焊接的需求。焊接夹渣的现象发生的概率较高，并且不能确定产生的位置。焊接夹渣对于管道金属质量产生的影响较大，并且与焊接位置清理以及焊接电流设置有着密切关联。对此，必须提升焊接工人的技术水平，提升综合能力，才能有效提升焊接的质量，才能有效确保管道安装的质量。

通过文献［9-10］方法，向96 孔板中加入100 μL 0.5 Mc 的ATCC 35984，于37 ℃培养24 h 后，去除菌液和培养基，用PBS缓冲液清洗3次，依次加入DSB（终质量浓度为64、32、16、8 和4 mg/L），万古霉素（终质量浓度为32、16、8、4和2 mg/L），每个浓度均设8个复孔；于37 ℃分别培养6、12和24 h后取出，PBS清洗3次，加XTT溶液（配制、处理方法同1.2.1），于37 ℃避光培养2 h。另设空白对照组（只加培养基）和阴性对照组（未加药剂的生物被膜生长对照），于630 nm波长下测出OD值。

1.2.4 激光共聚焦显微镜观察DSB对表皮葡萄球菌生物被膜的清除效率

吸取500 μL 0.5 Mc 的ATCC 35984 加入到激光共聚焦显微镜专用培养皿凹槽中，37 ℃培养24 h。弃去悬浮菌和培养基，用PBS 清洗1 次，吸取DSB（64、32 和16 mg/L）、万古霉素（32、16 和8 mg/L）各500 μL，分别加入到各培养皿凹槽中，37 ℃分别培养6、12 和24 h。设置阴性对照。

各组样本培养到规定时间后，吸弃上层培养基，用无菌PBS 洗去未黏附的浮游菌，吸取1 mL FUN1 染液（4 μL FUN1 染料加入10 mL GH 溶液中，配成FUN1 染液），加入各培养皿中，37 ℃避光染色30 min。激光共聚焦显微镜进行3D 扫描（激发波长532 nm，发射波长640 nm）；先用100 倍低倍镜观察生物被膜完整程度，然后设定Z 轴，选用200 倍视野连续扫描8 层并拍照；每组平行测3次。

1.3 数据处理

采用SPSS Statistics 24.0 软件，进行两样本间独立t 检验；数据以平均值±标准差（）表示，P＜0.05 代表差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 DSB对ATCC 35984生物被膜内细菌代谢的影响

如图1 所示，与阴性对照组相比，质量浓度为1 024、512、256 和128 mg/L 的DSB 对ATCC 35984 生物被膜内细菌的代谢有极显著影响（P ＜0.001）；质量浓度为64 mg/L时，对生物被膜内细菌的代谢亦有明显影响（P＜0.01）；当质量浓度为32、16 和8 mg/L 时，对ATCC 35984生物被膜内细菌的代谢无明显影响（P＞0.05）；表明DSB 在4 MIC 以上浓度时可影响生物被膜内细菌细胞的酶活力，显著抑制细胞代谢。与阴性对照组相比，质量浓度为512、256、128、64、32 和16 mg/L 的万古霉素，对ATCC 35984生物被膜内细菌的代谢有极显著影响（P＜0.001）；当质量浓度为8 和4 mg/L 时，对ATCC 35984生物被膜内菌的代谢无明显影响（P＞0.05），表明万古霉素在2 MIC 以上浓度时才可显著抑制生物被膜内细菌的代谢（图2）。

图1 不同质量浓度DSB对ATCC 35984生物被膜内菌代谢的影响（,n=8）Figure 1 Effects of different concentrations of DSB on bacterial metabolism in ATCC 35984 biofilm（,n=8）

图2 不同质量浓度万古霉素对ATCC 35984生物被膜内菌代谢的影响（,n=8）Figure 2 Effects of different concentrations of vancomycin on bacterial metabolism in ATCC 35984 biofilm（,n=8）

2.2 DSB对PIA形成的影响

与阳性对照ATCC 35984 产膜菌株和阴性对照ATCC 12228 不产膜菌株（图3）相比，DSB 质量浓度为16 和8 mg/L 时，分别作用4、8、12、16、20 和24 h 后，ATCC 35984 在刚果红培养基表面长出的菌落颜色均为黑色，表明在MIC 以下浓度的DSB 并不能显著影响PIA 的形成（图4）。万古霉素质量浓度为8 和4 mg/L，作用4、8、12 和16 h 时，ATCC 35984 在刚果红培养基表面长出的菌落颜色均为黑色，20 和24 h 时菌落颜色为红色，表明万古霉素在作用较长时间后可影响PIA的形成，结果见图5。

图3 PIA阳性菌株与PIA阴性菌株在刚果红培养基上菌落颜色对照Figure 3 Colony color comparison of PIA positive strains and PIA negative strains on Congo red medium

图4 DSB作用后ATCC 35984在刚果红培养基上菌落颜色Figure 4 Colony color of ATCC 35984 on Congo red medium after DSB treatment

2.3 DSB对表皮葡萄球菌生物被膜清除效率的测定

由表2可知，与阴性对照组相比，万古霉素的终质量浓度依次为32 和16 mg/L 在6 h 对ATCC 35984 已形成的生物被膜有较明显的清除作用（P＜0.001），其中质量浓度为32 mg/L万古霉素在6、12和24 h对ATCC35984的生物被膜清除作用均极显著（P＜0.001），但清除率最高只达到33.33%，8 mg/L 以下质量浓度的万古霉素在作用12和24 h时甚至促进了生物被膜菌的生长，具体机制尚不清楚。

图5 万古霉素作用后ATCC 35984在刚果红培养基上菌落颜色Figure 5 Colony color of ATCC 35984 on Congo red medium after vancomycin

表1 不同质量浓度的DSB对ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 1 Clearance efficiency and clearance rate of DSB with different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

表1 不同质量浓度的DSB对ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 1 Clearance efficiency and clearance rate of DSB with different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

注：*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；表中清除率计算公式：清除率（%）=（对照组OD630-实验组OD630）／ 对照组OD630×100%

质量浓度/（mg/L）时间/h 6 12 24 4 8 16 32 64阴性对照OD630 0.36±0.01**0.35±0.01***0.27±0.01***0.16±0.01***0.11±0.01***0.38±0.01清除率/%5.26 7.89 28.95 57.89 71.05 OD630 0.38±0.02***0.32±0.04***0.24±0.04***0.16±0.02***0.07±0.03***0.47±0.03清除率/%19.15 31.91 48.94 65.96 85.11 OD630 0.34±0.01*0.25±0.01***0.22±0.01***0.09±0.01***0.05±0.01***0.37±0.04清除率/%8.11 32.43 40.54 75.68 86.49

表2 不同质量浓度的万古霉素对ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 2 Clearance efficiency and clearance rate of vancomycin at different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

表2 不同质量浓度的万古霉素对ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 2 Clearance efficiency and clearance rate of vancomycin at different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

注：*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；表中清除率计算公式：清除率（%）=（对照组OD630-实验组OD630）／ 对照组OD630×100%

质量浓度/（mg/L）时间/h 6 12 24 2 4 8 16 32阴性对照OD630 0.42±0.04*0.48±0.03***0.37±0.06 0.28±0.03***0.28±0.04***0.38±0.03清除率/%0.00 0.00 2.63 26.32 26.32 OD630 0.35±0.07 0.48±0.05***0.54±0.10***0.42±0.12*0.20±0.03***0.30±0.01清除率/%0.00 0.00 0.00 0.00 33.33 OD630 0.45±0.05**0.45±0.05**0.44±0.06*0.38±0.05 0.28±0.02***0.38±0.04清除率/%0.00 0.00 0.00 0.00 26.32

2.4 激光共聚焦显微镜观察DSB 对表皮葡萄球菌生物被膜的清除效率

以激光共聚焦显微镜选用200 倍视野连续扫描8层并拍照。每组平行测3 次。所得结果（图6 和图7）显示：当细菌生物被膜完整，膜内细菌正常存活时，图片上荧光强烈；而当生物被膜被破坏，膜内细菌死亡或受损时，则图片所显示的荧光变弱或消失。通过观察发现，DSB对ATCC 35984形成的生物被膜清除的效果明显强于万古霉素（图6和图7）。

图6 激光共聚焦电子显微镜观察DSB对ATCC 35984生物被膜的清除作用（×200）Figure 6 Scavenging effect of DSB on ATCC 35984 biofilm observed by laser confocal electron microscope（×200）

图7 激光共聚焦电子显微镜观察万古霉素对ATCC 35984生物被膜的清除作用（×200）Figure 7 Scavenging effect of vancomycin on ATCC 35984 biofilm observed by laser confocal electron microscopy（×200）

3 讨论与结论

随着医疗技术的进步，各种医学材料（人工晶体、人工关节、内置导管及人工心脏瓣膜等）的使用大大提高了患者的生存率及生存质量，但内置的生物医学材料引起的医院感染也日益增加。表皮葡萄球菌可附着在生物材料表面进入人体，在材料表面形成生物被膜，有效地逃避人体免疫系统的识别和清除，对抗菌药物产生抵抗的作用，给临床治疗带来了诸多困难。

目前已知，细菌可通过黏附（0～4 h）、聚集（6～12 h）、成熟（24 h）、脱落（30～48 h）等4 个阶段形成生物被膜［11-12］，其中聚集阶段与表皮葡萄球菌产生的PIA、SarA 和群体感应系统agr的表达有关［13］，尤其依赖PIA的合成。细菌生物被膜逐渐“成熟”后，细菌可从生物被膜中脱落、迁徙而产生新的感染性病灶。

前期研究发现［5］，DSB对产膜表皮葡萄球菌ATCC 35984的MIC为16 mg/L，呈现良好的抑菌效果；无论是对惰性材料预处理或是直接干预，DSB 均具有显著抑制细菌初始黏附的作用。本研究发现：1 024、512、256、128和64 mg/L的DSB，对ATCC 35984生物被膜内细菌的代谢均有显著抑制作用（P＜0.01）；但与阳性对照药万古霉素相比，总体效果略弱。

在对生物被膜的清除作用方面，DSB 亦有较明显的效果；无论是通过XTT 减低法定量检测还是激光共聚焦电子显微镜定性检测，均显示质量浓度为64和32 mg/L的DSB 对ATCC 35984 生物被膜的清除作用极为显著（P＜0.001），清除效率在50%以上；总体效果强于万古霉素。但亦发现XTT减低法与激光共聚焦电子显微镜测得的结果并不完全一致，可能与显微镜观察点较少，生物被膜厚度不够均一有关。

在刚果红平板实验中，质量浓度为16 和8 mg/L时，DSB 对ATCC 35984 的PIA 合成并无明显抑制作用；可知DSB 对表皮葡萄球菌生物被膜聚集阶段关键物质PIA 的形成没有显著影响；推测DSB 可能是通过其他途径去影响或破坏表皮葡萄球菌生物被膜的。Valentine 等［14］证实，柠檬酸两性离子表面活性剂（Cit⁃ric acid zwitterionic surfactant，CAZS）能螯合生物被膜基质中的钙离子桥，减少生物被膜基质结构的稳定性；佘鹏飞等［15］体外研究证实CAZS 能使细菌生物被膜的尺寸和厚度大量减少，提示两性离子型表面活性剂可以通过破坏生物被膜基质的某些结构去影响生物被膜的完整性和稳定性，这为进一步探究DSB 对表皮葡萄球菌生物被膜的作用提供了参考。

在治疗感染性疾病方面，临床上通常首选抗生素杀死细菌控制感染。然而大量使用甚至滥用抗生素，容易造成细菌耐药，且细菌耐药的速度远远快于抗生素研发的速度。目前尚未发现能对抗细菌生物被膜的强效抗生素。两性离子表面活性剂最大的特点是无论在酸性、中性或碱性的水溶液中都能溶解。本研究证实了两性离子表面活性剂DSB对表皮葡萄球菌生物被膜内细菌活力的影响、对生物被膜清除的作用，提示DSB 可能是一种有效的表皮葡萄球菌生物被膜的清除剂，这为医用内置材料及医疗器械等的除菌、杀菌提供了另一种选择。