三峡库区香溪河沉积物厌氧氨氧化菌的时空分布

赵折红，李月秋，皮海廷，左 群，王思雅，侯宇宁，李 静，李 宁，吕育财

（1.三峡大学湖北省生物酵素工程技术研究中心，宜昌443000；2.三峡大学水利与环境学院，宜昌443000；3.三峡大学生物与制药学院，宜昌443000）

近年来，由AnAOB 介导的ANAMMOX 反应因其除污成本低、脱氮效能高已经成功地被用于实际生产活动。已经被发现并报道的AnAOB 已有27 种分属于6属，该菌对氧极其敏感，生长缓慢，仍未成功分离。AnAOB 不仅存在于海洋生态系统中，还存在于各种缺氧环境中，生存环境较为多样性［4-7］。AnAOB 生存环境的温度、总有机碳和亚硝酸盐等理化指标的含量会影响AnAOB 的分布及丰度。ANAMMOX 过程中肼是代谢中间体，在厌氧氨氧化体内生成。研究发现功能性hzs 基因可作为特定分子标记用于量化和表征AnAOB［8］，标记不同基因得到的AnAOB 丰度值存在不一致性，这种不一致由引物引起。姜晓芬［9］通过16S rRNA基因扩增测序和qPCR技术研究了长江口及近岸AnAOB 的菌群结构及丰度时发现从淡水到海水菌群结构有明显变化，优势菌属由Brocadia 变为Scalindua。Bai 等［10］发现农业土壤中的优势菌属为Brocadia 和Kuenenia，所以厌氧氨氧化菌被认为是有栖息地特异性的细菌。

沉积物是水域生态系统的重要组分，营养物质和污染物可经过沉积进入底泥［11］，对底泥微生物有重要影响。香溪河是三峡库区湖北省库区最大入库支流，其表层沉积物中TN 和总磷（TP）污染指数均超过最低污染水平［12］，是研究库区水温和富营养的典型区域，AnAOB 可通过介导ANAMMOX 反应对香溪河N 素污染的修复作出贡献。本研究采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术探讨香溪河不同位点不同季节沉积物AnAOB 的时空分布差异，为三峡库区香溪河沉积物中AnAOB的研究提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及试剂

根据香溪河的流域特征，分别在香溪河上、中、下游设立取样点，位点CJ#位于长江与香溪河交汇处，编号为CJXX，30°57'56″N，110°44'56″E，记为e；位点1#，编号为XX01，30°58'47″N，110°45'34″E，记为d；位点2#，编号为XX04，31°6'24″N，110°46'46″E，记为c；位点3#，编号为XX06，31°8'8″N，110°46'42″E，记为b；位点4#，编号为XX08，31°10'9″N，110°45'54″E，记为a。在此5 个点位，利用长江取样船以及特制的底泥取样器获得底泥，主要区域为沉积物水层以下0～10 cm 底泥，每个位点纵向每2 cm 为一个样品，无重复。分两年时间取样，分别是2016 年春夏秋冬四季和2017 年春夏冬三季。在此特别指出2017 年样品没有分层，2017 年秋季因香溪河水流量大未采集到样品。所获得底泥被封存好后带回实验室，置于-80 ℃保存。试剂盒：FastDNATMSPIN Kit for Soil 和ChamQ SYBR qP⁃CR Master Mix。

1.2 沉积物底泥理化指标的测定

理化指标测定前，将沉积物风干、过筛预处理，最后计算结果以沉积物质量（kg）为单位。总氮（TN）测定采用JK-9830A 凯氏定氮仪进行分析［13］，硝态氮测定采用酚二磺酸比色法［14］，亚硝态氮和氨氮测定采用分光光度法［15］、硫酸根离子采用硫酸钡沉淀法［16］，重铬酸钾容量法测定有机碳（TOC）［17］。所有样品测定均进行3次重复。

1.3 沉积物底泥中微生物总DNA的提取和PCR扩增

沉积物样品总DNA 抽提方法参照试剂盒说明书。0.5 g 沉积物底泥置于Lysing Matrix E 管中，提取沉积物微生物总DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳确认DNA 的完整性，最后将提取好的DNA 样品保存在-80 ℃冰箱。PCR 扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，35个循环。

1.4 沉积物AnAOB的qPCR

AnAOB 的定量PCR 采用ChamQ SYBR qPCR Mas⁃ter Mix 试剂盒进行，所有样品3 个重复，利用CFX96 荧光定量PCR 检测系统（BIO⁃RAD，USA）进行PCR。AnAOB引物为：hzsA_1597F，WTYGGKTATCARTATG⁃TAG 和hzsA_1857R，AAABGGYGAATCATARTGGC。反应体系为（20 μL）：10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，上游引物和下游引物各0.4 μL，模板DNA 2 μL，无菌水7.2 μL。扩增条件如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40 个循环。在所有实验中，对不含模板DNA 的阴性对照进行相同qPCR 程序，以检测和排除任何可能的污染或遗留。标准DNA被稀释为102、103、104、105、106、107、108和109共8 个梯度，同步PCR。标准DNA 制作方法为，沉积物环境样品DNA 为模板，利用hzsA_1597F/hzsA_1857R 扩增AnAOB DNA。

1.5 统计分析

基于标准曲线计算基因丰度，转换为基因拷贝数，假设100%DNA 提取效率。柱状图采用sigmaPlot 8.5制作，理化指标和AnAOB 丰度之间相关性通过SPSS 20.0 确定，P ＜0.05 水平的差异被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 香溪河碳、氮、硫酸盐含量变化

图1 香溪河沉积物理化性质Figure 1 The physicochemical factors of Xiangxi River

测定位点的沉积物理化参数包括TN、TOC、硝态氮、亚硝态氮、氨态氮、硫酸根离子（图1）。TN、TOC 分别为0.66～3.31 g/kg 和4.17～19.13 g/kg；同时测定的硝态氮含量在0.10～1.90 mg/kg，亚硝态氮含量变化范围是2.14～8.81 mg/kg，氨态氮含量变化范围是0.33～2.56 mg/kg；硫酸根离子含量是0.13～0.28 g/kg。

2.2 香溪河沉积物中AnAOB的丰度

qPCR 结果显示，在所有位点皆检测到AnAOB，丰度范围跨度较大，AnAOB 数量较为可观。在时间上，AnAOB丰度在a和e位点显示相同规律，即秋季＞冬季＞春季＞夏季，b、c和d位点的分布特征不明显，但5位点的AnAOB 丰度都是秋季最高［图2（a）］。2017 年所有位点AnAOB 丰度介于6.79×106～1.25×108g-1，丰度最高值出现在c 位点冬季，d 位点春季丰度最低［图2（b）］。

图2 沉积物AnAOB的丰度Figure 2 AnAOB abundance of sediments

图3 沉积物AnAOB的丰度Figure 3 AnAOB abundance of sediments

2016 年 所 有 样 点AnAOB 丰 度 介 于1.45×104～3.16×109g-1，c位点秋季6～8 cm 最高，冬季8～10 cm 最低（图3）。在空间上，e位点夏秋两季显示随沉积物深度增加，AnAOB 丰度先增加（0～8 cm）后降低（8～10 cm）的趋势；d位点春冬两季和e位点冬季的AnAOB丰度亦显示出随沉积物深度增加AnAOB 丰度先增加（0～6 cm）后降低（6～10 cm）的趋势。AnAOB 最高丰度和最低丰度皆在2016 年c 位点出现，分别是秋季6～8 cm和冬季8～10 cm。

2.3 理化因子与AnAOB丰度的关系

AnAOB 丰度和理化因子之间的关系通过spear⁃man 相关系数来确定（表1）。结果显示AnAOB 丰度与TN（图1）显著正相关，与TOC 和硝态氮显著负相关，与其他理化因子无显著相关性。这表明沉积物AnAOB丰度受TN和TOC影响较大。双因素方差分析结果（表2）显示sig值均大于0.05，表明不同理化因子和不同季节AnAOB丰度在0.05水平上无显著性差异。

3 讨论与结论

3.1 不同季节、不同地理位置下的AnAOB分布差异

香溪河属亚热带大陆性季风气候，是AnAOB 的理想生境，存在AnAOB 的可能性极大。通过qPCR 技术研究三峡库区香溪河沉积物中AnAOB 分布特征，结果表明不同季节不同位点AnAOB 丰度变化较明显，不同地理位置下的AnAOB丰度有明显差异。

表1 理化因子与AnAOB丰度的spearman相关分析Table 1 Spearman correlation analysis of physicochemical factors and AnAOB abundance

表2 理化因子和季节对AnAOB丰度的显著性差异参数（P＜0.05）Table 2 Significant difference parameters of physicochemical factors and seasons on AnAOB abundance（P＜0.05）

不同季节AnAOB 丰度也显示较大差异，且2016年AnAOB丰度大小相差多个数量级（图3）。不同季节AnAOB 丰度和群落结构等不同且差异明显［18］。香溪河秋季温度较高，冬季多雨雪，温度过高或过低均会抑制AnAOB 活性。另一方面，不同位点AnAOB 丰度变化可能与DNA 提取效率和引物扩增效率有关。此外，a 距离三峡库区最远，e 位点距离三峡库区最近，有最大和最小的水流交换频率，水流交换使水体中氧增多，AnAOB是严格厌氧菌，氧气饱和度大于2%时即对AnAOB产生抑制［19］。

香溪河沉积物AnAOB 丰度有随着沉积物深度加深而先增加后降低的趋势，太湖沉积物［20］、杭州稻田土壤中［21］AnAOB 丰度有随着沉积物深度加深而先增加后降低的趋势。南海沉积物中AnAOB 丰度随深度加深，与AnAOB 相关的浮霉菌门多样性降低，且在超过5 cm 沉积物深处未检测到AnAOB 存在［22］。以上对垂直方向的AnAOB 丰度变化得出的结果不尽相同，说明随深度增加，不同土壤中AnAOB 分布规律不同且较复杂，有待进一步研究。

3.2 香溪河沉积物理化因素对AnAOB丰度的影响

AnAOB 丰度与理化因子存在显著相关性，同一位点不同季节沉积物AnAOB 丰度明显不同（图2），与不同理化因子和不同季节下的AnAOB 丰度无显著差异结论存在矛盾。本研究中，理化指标测定采取沉积物风干、磨细再过筛，最后通过碳酸钠溶液浸提后测定，此一系列过程可导致各种形式氮和硫的流失。香溪河距离人类聚居区近，人类活动产生的各种有害物质排入其中，导致2016年和2017年沉积物理化指标相差较大。香溪河年平均气温为16 ℃，全年高温天气较多，沉积物氨态氮经反扩散作用被沉积物吸附［23］，吸附过程受温度影响较大，温度越高吸附越少［24］。硝态氮是沉积物中有机氮被底栖微生物降解和化学氧化还原生成的交换态氮，可被沉积物吸附也可被释放。李杰等［25］对红树林湿地不同深度的AnAOB 丰度进行研究时发现硝态氮与AnAOB 丰度正相关，研究得出硝态氮与AnAOB 丰度显著负相关，这并不支持硝酸盐和亚硝酸盐作为ANAMMOX 电子受体的这一事实。之所以出现这种结果可能是香溪河沉积物AnAOB 丰度受沉积物理化因子影响较大。

氨氧化古菌和氨氧化细菌的分布由N 水平控制［26］，香溪河沉积物TN 和硝态氮对AnAOB 丰度有显著影响，说明三峡库区香溪河沉积物AnAOB 同样受N水平控制，这也与李萌［27］的研究结果相似。Thamdrup等［28］指出环境有机质、硫化物等可影响ANAMMOX 过程。Li 等［29］研究发现香港米埔红树林沉积物中的AnAOB 丰度与TOC 显著负相关，这与本研究结果相符。虽然氨氧化过程必须在TOC 存在条件下进行，但碳源是CO2形态而非TOC［30］，当TOC 浓度超过一定量时，对ANAMMOX有抑制作用［31-32］。

目前国内对于AnAOB 的研究主要集中在利用厌氧氨氧化反应处理污水的工艺方面，对在各种生境中的AnAOB 丰度研究较少，有关生境中AnAOB 的研究越来越受到科学工作者的关注。AnAOB 研究起步较晚，目前还尚未实现AnAOB 的单株分离，了解生境中AnAOB 分布特征及影响其生长繁殖等的理化因素，可为AnAOB 富集培养及分离纯化等提供理论依据，有利于ANAMMOX 污水处理效率的提高，改善人为造成的环境污染问题。