基于网络药理学的土鳖虫破血逐瘀作用机制研究△

王少平，赵一慕，李盼盼，宋书祎，韩菲，张加余，代龙

滨州医学院，山东 烟台 264003

土鳖虫，首载于《神农本草经》，具有破血逐瘀、续筋接骨的功效，主治血积癥瘕、破坚、下血闭等证[1]。现代临床其多用于高血脂、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗。对土鳖虫化学成分进行系统研究，发现其含有氨基酸、蛋白质、挥发油、脂肪酸及微量元素等成分[2-4]。

心脑血管疾病泛指由高脂血症、动脉粥样硬化、高血压等疾病所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性病变[5]。据统计，每年全世界死于心脑血管疾病的人数高达1300万人，死亡率居各种疾病首位。中医认为心血管疾病的主要病机是痰阻血凝、机体气血失调、血运受阻所致。土鳖虫具有破血逐瘀的疗效，是治疗此类疾病的有效药物[6-9]，但其药效物质基础和分子机制至今尚不明确。因此，分析土鳖虫的有效活性成分和作用靶点、揭示其可能的作用机制具有现实意义。

网络药理学作为近年出现的一门新兴技术，融合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，从多成分、多靶点的研究策略出发，实现药物作用机制的综合网络分析[10]。网络药理学的整体性、系统性的特点与中医药理论具有高度一致性，目前网络药理学已被广泛用于中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述。因此，本研究基于网络药理学的整体性角度预测土鳖虫破血逐瘀的作用机制，为土鳖虫临床使用提供参考。

1 材料

1.1 药材与试剂

土鳖虫，购自安徽亳州药材市场，经滨州医学院林莺教授鉴定为鳖蠊科中华冀土鳖Steleophagaplancyi(Boleny)的雌虫；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，硫酸铵、石油醚、正丁醇(分析纯，天津富宇化工厂)；去离子水(杭州娃哈哈纯净水有限公司)；1000 Da纳滤膜(美国GE公司)。

1.2 仪器

HH-601型超级恒温水浴锅(镇江瑞祥仪器有限公司)；HT52型台式高速离心机(上海安亭精密仪器有限公司)；TGH21型旋转蒸发仪(东京理化精密仪器有限公司)；M22型冷冻干燥机(北京四环仪器设备有限公司)。

2 方法

2.1 土鳖虫活性成分及靶点的筛选

通过检索中国知网(CNKI)、维普、万方、Web of Science(http：//www.wokinfo.com/)、PubMed(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等相关国内外文献数据库查阅与土鳖虫相关文献，并结合PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和SwissADME(http：//www.swissadme.ch)等数据库，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为阈值得到土鳖虫的活性成分。采用SwissTargetPrediction数据库(http：//www.swiss.ch)和TCMSP数据库(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)对所得成分的对应靶点进行筛选。

2.2 “成分-靶点”网络构建

将上述获得的活性成分及靶点关系导入网络图像化软件Cytoscape 3.2.1进行构建和分析，完成“成分-靶点”网络的构建。以“节点”(node)表示分子和靶蛋白，“边”(edge)表示成分与靶点之间的关系，表述网络中的拓扑属性。

2.3 相关疾病靶点检索及土鳖虫破血逐瘀靶点的预测

基于中医对心脑血管疾病的认识，结合西医临床心脑血管疾病的表现，共筛选出高血压、高血脂、弥漫性血栓等与中医“破血逐瘀”有关的17种疾病，采用GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库(https：//www.omim.org/)、TTD数据库(http：//db.idrblab.net/ttd/)、HPO数据库(https：//hpo.jax.org/)检索每个疾病的相关靶点，整合重复靶点后得到“破血逐瘀”的作用靶点。

采用Draw Venn Diagram数据库(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)对已知土鳖虫活性成分的靶点和“破血逐瘀”的作用靶点进行交互分析，得出交互靶点，作为土鳖虫发挥破血逐瘀作用的关键靶点。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

借助STRING数据库(https：//string-db.org/)，将集合靶点映射到PPI网络中。基于数据库中的数据Dgreement(D值)、Betweenment(B值)和Clossment(C值)等参数，结合相关系数P<0.05筛选PPI网络中的关键靶点。

2.5 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析

将交互靶点采用Cytoscape 3.7.1软件的ClueGO分析插件和FUNRich 3.6.3软件、DAVID数据库进行GO、KEGG分析，并以P<0.01为阈值，筛选出土鳖虫破血逐瘀功效所涉及的生物功能。

2.6 土鳖虫不同组分体外药效实验

2.6.1土鳖虫总蛋白制备 取土鳖虫药材2 kg，粉碎过100目筛，加3倍量pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，在37 ℃下温浸提取1.0 h，4500 r·min-1离心10 min(离心半径为10 cm)得上清液。4 ℃冷藏处理12 h 后5000 r·min-1离心10 min(离心半径为10 cm)除去沉淀，上清液加硫酸铵至浓度为20%，继续放置于4 ℃冷藏处理12 h，4500 r·min-1离心10 min(离心半径10 cm)，留取沉淀；沉淀加10倍量去离子水溶解后过1000 Da纳滤膜除去硫酸铵。大分子溶液冷藏于-80 ℃冰箱12 h，采用冷冻干燥机干燥既得土鳖虫总蛋白。

2.6.2土鳖虫脂肪油制备 取土鳖虫药材500 g，粉碎过100目筛，加5倍量沸程为60～90 ℃的石油醚，回流提取4.0 h。3500 r·min-1离心10 min(离心半径为10 cm)获得石油醚提取液，40 ℃下减压回收石油醚，即得土鳖虫脂肪油。

2.6.3土鳖虫总核苷和总多糖提取 依据文献方法[11]对土鳖虫总核苷和总多糖进行提取，得到土鳖虫总核苷溶液和总多糖溶液。

2.6.4体外纤溶实验 取磷酸二氢钠、磷酸氢二钠适量，配制成pH=7.25的PBS，PBS和0.9%氯化钠溶液按照1∶17混合制成工作液，再取纤维蛋白原适量，采用工作液溶解配制成0.03 g·L-1溶液，取工作液加热至沸腾后加入预先称好的琼脂糖，配制成0.5%琼脂糖溶液。在此期间采用0.9%氯化钠溶液配制10 U·mL-1的凝血酶溶液，完全溶解后的琼脂糖溶液冷却至50 ℃，迅速加入纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，导入培养皿内。打孔，放入冰箱凝固后备用。以不同活力尿激酶溶液作为对照品，以活力对数为横坐标，以溶圈面积为纵坐标绘制曲线。

3 结果

3.1 土鳖虫活性成分筛选及作用靶点的预测

通过对现有文献中已报道的土鳖虫成分进行系统整理[12-14]，结合数据库共搜集到成分108个。经SwissADME数据库的“GI absorption”功能对其进行筛选共获得入血成分54个，多为小分子脂肪酸、核苷和氨基酸类成分，结果见表1。利用SwissTargetPrediction等数据库对54种入血成分进行作用靶点预测，合并重复靶点共获得相关靶点653个。

表1 土鳖虫活性成分筛选

3.2 土鳖虫“成分-靶点”网络构建和分析

将上述活性成分及预测靶点导入网络图像化软件Cytoscape 3.2.1进行关系网络的绘制和分析，见图1。通过网络构建共获得693个节点和3240个边。

注：红色菱形为土鳖虫活性成分；黄色椭圆形为成分作用靶点。

3.3 土鳖虫治疗破血逐瘀相关疾病靶点

经数据库查询与破血逐瘀相关的18种疾病，采用GeneCards数据库获取与破血逐瘀相关作用靶点共16 141个，建立疾病靶点库。并将疾病靶点与土鳖虫活性成分靶点进行交互分析，得到土鳖虫治疗破血逐瘀相关疾病的靶点共26个，结果见表2和图2。

表2 土鳖虫治疗破血逐瘀相关疾病靶点

图2 土鳖虫治疗破血逐瘀相关靶点

3.4 PPI网络构建与分析

经STRING数据库对交互靶点进行PPI分析，结果表明，26个靶点之间联系性并不紧密，共获得26个节点和26条边。而机体的内在调控往往不是单一信号通路支配，而是复杂的调控网络。而PPI数据为寻找靶点的直接、间接调控作用关系提供了可能。PPI的结果表明，目前已知的土鳖虫入血成分所对应靶点并不能完全反映土鳖虫的功效(图3)。

图3 土鳖虫活性成分破血逐瘀靶点PPI网络

3.5 土鳖虫破血逐瘀可能的机制分析

对交互靶点进行GO和KEGG分析。细胞组分(cell component，CC)分析得出土鳖虫入血成分可影响细胞膜内外通透性、细胞核DNA表达、内质网、线粒体、细胞颗粒状因子释放、细胞质内环境变化等40种组分，其中对内质网和线粒体影响为主。表明土鳖虫可干预细胞因子释放以及DNA转录来实现对疾病的治疗作用。分子功能(molecular function，MF)分析得出土鳖虫已知成分主要涉及氧化还原酶、丝氨酸肽酶、半胱氨酸型肽酶、磷酸二酯水解酶、天冬氨酸型信号肽酶和裂解酶等10个分子活化与裂解功能。生物过程(biological process，BP)分析得出土鳖虫已知成分主要涉及机体的蛋白质代谢、能量代谢、细胞生长运输、细胞信号转导、细胞凋亡等9个生物功能(图4)。

注：A.CC分析；B.MF分析；C.BP分析。

CC、MF和BP结果充分揭示了土鳖虫已知成分可以通过影响细胞膜外环境使细胞膜表面相应受体得到感知，激活相关分子的活动来干预相关基因的表达；细胞核内DNA连同内质网、线粒体和高尔基体等众多细胞器通过产生相关因子、吞噬细胞或细胞微粒等来改变细胞质的组成，进而影响机体的代谢过程。但以上结果不能完全表示土鳖虫直接作用的途径，因此需联合KEGG信号通路分析结果来具体阐释。

采用KEGG数据库、DAVID数据库、Cytoscape 3.7.1软件和FUNRich软件对交互靶点进行通路富集分析(图5)。通过KEGG富集分析得出土鳖虫已知成分通过50条通路途径治疗心血管疾病，主要涉及嘌呤代谢通路、细胞能量代谢通路、环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路、Toll样受体信号通路、醛固酮合成代谢通路、三酰甘油合成通路等。以P<0.05位阈值进行分析，得出主要生物信号通路13条，将13条主要信号通路的对应靶点与土鳖虫已知成分的相应靶点进行交互分析，结果表明，土鳖虫中的54个成分中只有39个成分对心血管疾病具有潜在作用，而39个成分所对应的靶点未全部反映在13条主要通路上。结合PPI分析和GO分析结果，说明目前土鳖虫已知成分并不能很好地治疗心血管疾病。

图5 土鳖虫破血逐瘀的通路-成分-靶点富集分析

3.6 体外纤溶活性实验结果

以不同活力尿激酶为对照溶液，以活力对数为横坐标，以溶圈面积为纵坐标绘制曲线(图6)。标准曲线为Y=1.577 4X-1.873 6，r=0.998 4，线性关系良好。

体外纤溶活性实验结果(图6)表明，土鳖虫水溶性蛋白纤溶活性较其他成分强，差异有统计学意义。结果说明土鳖虫蛋白可能是其活血化瘀功效的物质基础。

注：A.体外纤溶标准曲线；B.体外纤溶活性；**P<0.01。

4 讨论

本实验对土鳖虫主要活性成分、生物功能以及作用信号通路进行网络药理学研究分析，结合OB和DL，筛选出土鳖虫与破血逐瘀相关的活性成分共54个。利用Cytoscape 3.7.1软件构建土鳖虫“成分-靶点”网络，揭示土鳖虫具有多成分-多靶点的作用特点。54个成分对应653个靶点，而GeneCard数据库仅识别出613个靶点信息，最终得出54个成分对应与破血逐瘀功效相关的靶点为26个。但主要活性成分与重要靶蛋白之间无较好的结合性，靶蛋白之间相互作用构成了较为简单的网络，说明这些靶蛋白之间无很强的相互作用关系，不能很好地揭示土鳖虫破血逐瘀的机制。

土鳖虫入血的54种成分主要为有机酸类、核苷类和游离氨基酸类物质，结合实验结果可知，小分子直接跨膜进入细胞，影响相关受体进而影响相关通路，发挥相应的生物活性，达到治疗疾病的目的。但土鳖虫中主要成分为蛋白质，而大分子蛋白质无法直接跨膜，需经胃肠道消化后方可进入人体发挥药效作用[15-17]，因此网络药理学实验中根据OB和DL等参数作为筛选成分的依据时会直接将土鳖虫蛋白质完全剔除。而体外纤溶实验结果表明，土鳖虫水溶性蛋白质较其他成分具有更强的降解纤维蛋白能力。综上所述，动物药采用网络药理学等分子靶点预测功能具有一定片面性。因此实验后期会针对土鳖虫各物质，特别注重蛋白质等大分子物质开展活血化瘀相关实验研究，探究土鳖虫作用于心血管疾病的物质基础和作用机制。