软枣猕猴桃高效快繁体系研究

吕海燕，李大卫，费早霞，钟彩虹

（中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室/中国科学院武汉植物园/中国科学院猕猴桃产业技术工程实验室，武汉430074）

软枣猕猴桃（Actinidia arguta）果型漂亮，平均单果重4～20 g，果面光滑，软熟果实无需剥皮，直接食用，深受广大消费者的喜爱。软枣猕猴桃果实耐储藏性一般。植株树势强健，结果以中、长果枝为主，实生苗第6年株产6～8 kg。虽然软枣猕猴桃能适应辽宁省5.0～8.2℃的年均温，也能适应福建省16.9～17.9℃的年均温，但在华中地区武汉市，从北方引进的软枣猕猴桃出现适应性分化，部分能开花结果，夏季生长缓慢，果实风味差；部分花量少，甚至有些年份出现只长树不开花的现象。为了培育能适应华中地区的软枣猕猴桃新品种，本研究引进软枣猕猴桃的种子实生播种，从实生后代中选择育种。猕枣1号和猕枣2号是中国科学院武汉植物园自主研发选育的软枣猕猴桃新品种，能很好地适应华中地区的生态环境，快速达到丰产［1］。为了加快这2个新品种的推广，采用组织培养技术进行繁殖是最快速和有效的方法之一，目前猕枣1号、猕枣2号种苗来源主要是扦插苗和嫁接苗，组培育苗技术还未见报道，然而扦插成活率不高以及接穗质量及数量的限制成为猕枣1号、猕枣2号大面积推广及产业化生产的一个瓶颈［2］。

针对现有技术中存在的缺陷，本研究的目的在于提供一种软枣猕猴桃品种的组培快繁方法，即直接通过组织培养方法获得品质均一、优良的离体猕枣1号、猕枣2号组培种苗，并通过优化离体快繁体系，实现快速繁育猕枣1号、猕枣2号软枣猕猴桃优质种苗，以供生产中不断增长的种苗需求。

1 材料与方法

1.1 材料

材料采自中国科学院武汉植物园国家猕猴桃种质资源圃。于3月中下旬，晴天上午露水干后，采猕枣1号和猕枣2号健康植株新萌发的幼嫩茎段作为外植体待用。

1.2 外植体消毒

挑取外植体于自来水下纱布遮盖冲洗2 h，于超净工作台上，75%乙醇浸泡1 min，0.5%升汞溶液涮洗5 min，期间不断摇晃，使消毒液与外植体充分、均匀接触，消毒结束后，用无菌水冲洗外植体4～5遍，彻底洗净外植体表面附着的消毒液，再于灭菌滤纸上晾干外植体［3］，去掉嫩茎上的叶片，切成带1～2个腋芽的茎段，置于芽诱导培养基上培养。

1.3 培养条件

组培室培养温度（26±2）℃，光照1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d。

1.4 诱导培养获得无菌苗

在MS培养基中添加不同浓度的6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.8、1.2 mg/L），每个处理接种10瓶，每瓶4个茎段外植体，试验重复3次，以MS培养基为对照，培养25 d后比较观察腋芽萌发情况。

1.5 增殖培养

经过芽诱导获得无菌芽苗后，切取芽苗带2～3片叶，转接至含6-BA（0.1、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0.10、0.25、0.50 mg/L）的芽增殖培养基进行增殖培养。35 d后观察记录芽增殖情况并统计芽增殖数量。

1.6 生根培养

以1/2 MS为基本培养基，分别添加不同浓度的IBA（0.2、0.5 mg/L）和NAA（0.2、0.5 mg/L）。将无菌苗切成含1～2片叶的茎段（2.5～3.0 cm），接种于生根培养基进行生根诱导，1周后观察生根情况，20 d后统计生根率。

1.7 移栽

当新生根长1.5～2.5 cm时将组培苗移至智能温室，打开瓶盖，直接取出组培苗，并用自来水清洗种苗基部培养基，移栽到盛有基质的穴盘中，基质由2∶1∶1的黄壤土∶草炭土∶珍珠岩组成。温室内温度控制在20～30℃，移栽后第1～2周种苗环境湿度为75%～85%，第3～4周适当降低空气湿度，移栽时浇足水，以后等基质表面稍干时再浇，但对出现萎蔫的组培苗及时补水。一个月后，常规管理，适时浇水。

2 结果与分析

2.1 芽的诱导培养

在芽的诱导试验中（表1），随着6-BA浓度的升高，外植体茎段腋芽萌发率呈先上升再降低的趋势，当6-BA浓度为2.0 mg/L时，外植体底部形成愈伤团，且不易分化，影响外植体本身腋芽的萌发数量及速率。方差分析结果显示，当6-BA的浓度为1.0mg/L时，猕枣1号和猕枣2号的腋芽萌发率均最高，分别达95.8%和97.5%，与另外2个6-BA浓度的腋芽萌发率差异显著，消毒外植体上的每个腋芽均快速萌发并旺盛生长，获得无菌苗体系供后期增殖试验的材料需求。而不同浓度的NAA对猕枣1号和猕枣2号的腋芽萌发率影响无显著差异。综合各处理方差分析结果表明，猕枣1号、猕枣2号腋芽萌发最佳培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA（图1）。

表1 不同浓度激素组合对腋芽萌发的影响

2.2 增殖培养

获得无菌苗体系后，切取无菌苗茎段做增殖培养，猕枣1号和猕枣2号在各处理下增殖率均能达70%以上（表2、图2）。2个品种的软枣猕猴桃经过增殖培养都能形成2～4株丛芽，且每个增殖的芽体株高单个增殖周期内都能达4～5 cm，经过45 d的增殖周期，猕枣2号的增殖系数最高可达6.3，猕枣1号增殖系数最高可达4.3。猕枣1号与猕枣2号最佳增殖培养基配方均为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA。

2.3 生根培养与移栽

由表3可知，IBA对猕枣1号和猕枣2号的生根效果要优于NAA，当培养基中IBA浓度为0.5 mg/L时，猕枣1号和猕枣2号的生根率均可达100%，生根8～15条，根系粗壮。尽管NAA为0.2 mg/L时猕枣1号和猕枣2号的生根率也能达98%和100%，但种苗之间生根差异大，根的状态也不一致、不均一。

生根培养3周后，对生根苗进行移栽，45 d后统计成活率，猕枣1号移栽成活率达95.0%，猕枣2号移栽成活率达96.5%。种苗移栽3个月后，根系发达包裹穴盘土球，即可进行2次换盆移栽，换盆后，迅速生长，6～8个月后，植株根颈部直径能达0.4～0.6 cm，种苗长势整齐一致（图3）。

图1 6-BA/NAA 9组不同浓度处理下猕枣1号和猕枣2号的腋芽萌发率

表2 不同浓度激素组合对带芽茎段再生增殖的影响

图2 不同浓度激素组合对带芽茎段再生增殖的影响

表3 不同激素浓度对生根的影响

图3 猕枣1号和猕枣2号增殖、生根及移栽

3 讨论

猕猴桃组织培养技术研究已随着猕猴桃产业化的推广而迅速发展起来，很多优良猕猴桃品种的组织培养快繁体系也逐渐建立［4，5］，本研究以猕枣1号和猕枣2号的幼嫩茎段为材料，开发其高效的离体快繁体系，为该品种后期产业化进程中大量种苗的需求提供技术支持。猕猴桃组织培养可供选择的外植体很多，中华类猕猴桃最佳外植体来源多为叶片、叶柄、茎尖等再生能力强的部位［6-9］，而软枣猕猴桃因为其自身强大的再生能力及成枝力，通过茎段的离体快繁就能迅速满足组织培养单个增殖周期中增殖系数的最低成本需求。本研究中，通过调整常用植物生长调节剂6-BA和NAA的浓度及比例［10，11］，找到软枣猕猴桃猕枣1号和猕枣2号的茎段快繁最佳组合为1.0 mg/L 6-BA和0.8 mg/L NAA，增殖系数分别高达4.3和6.3，大大降低软枣猕猴桃工厂化种苗生产的成本，为软枣组培种苗的工厂化生产提供有力保证。