热毒宁与血必净“同病异治”新型冠状病毒肺炎的网络药理学作用机制研究

蔡孟成，金永生

(1.海军军医大学基础医学院，上海 200433；2.海军军医大学药学院有机化学教研室，上海 200433)

同病异治是指对于同一疾病，因人、因地、因时的不同，或由于病情的发展、病型的各异、病机的变化差异，治疗时应根据不同的情况采用不同的治疗方法[1]。新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是一种急性感染性肺炎，重型患者可出现呼吸困难、高热神昏等症状，危重型患者可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒血症。目前，COVID-19诊疗方案中采用热毒宁、血必净注射液对重型和危重型患者进行治疗[2]，热毒宁处方由金银花、青蒿、栀子组成，功效以清热解毒为主；血必净处方由丹参、红花、当归、赤芍、川芎组成，功效以凉血活血为主。这两种注射液的药物组成差异较大，但都对COVID-19有确切疗效。本研究利用网络药理学探究热毒宁和血必净“同病异治”COVID-19的可能作用机制，以期为COVID-19的治疗及相关药物研发提供基础。

1 材料和方法

1.1 药物成分与靶点的筛选 本研究采用计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 检索热毒宁(处方中含金银花、青蒿、栀子)与血必净(处方中含丹参、红花、当归、赤芍、川芎)的潜在活性成分。根据化合物口服生物利用度≥30%与类药性≥0.18进行筛选，并利用TCMSP获取这些潜在活性成分对应的靶点[3]。

1.2 COVID-19靶点的收集 分别以“novel coronavirus pneumonia”、“COVID-19”、“SARS-Cov-2”为关键词，检索GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)，获取COVID-19的靶点，将检索到的靶点进行交集，将交集靶点作为研究对象。

1.3 药物-疾病交集靶点 将1.1项的热毒宁靶点与1.2项的COVID-19靶点进行交集，获得热毒宁和COVID-19交集靶点；将1.1项的血必净靶点与1.2项的COVID-19靶点进行交集，获得血必净和COVID-19交集靶点。再将两部分交集靶点进行交集，获得的交集靶点作为两药治疗COVID-19的关键靶点。

1.4 构建活性成分-靶点网络图 为了进一步明确COVID-19同病异治的机制，利用Cytoscape 3.6.1软件构建出化合物-靶点网络，将活性成分与靶点的作用关系可视化。

1.5 构建蛋白相互作用网络 为了明确靶点与靶点之间的相互作用关系，将热毒宁和血必净治疗COVID-19的交集靶点上传至线上软件String10.5 (http://stringdb.org)，构建蛋白相互作用网络。物种选择为 Homosapiens，其余参数保持默认设置，获取靶点与靶点之间的相互作用关系以及度值，利用Cytoscape 3.6.1软件将结果可视化。

1.6 KEGG富集分析 利用Cytoscape 3.6.1软件中的ClueGo功能将热毒宁和血必净治疗COVID-19的交集靶点进行KEGG富集分析，选择P<0.05并且通路内最少含有7个热毒宁和血必净治疗COVID-19交集靶点的通路，将结果可视化。利用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)获取热毒宁和血必净治疗COVID-19的交集靶点的信号通路图。

1.7 分子对接 利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索1.4项下高度值的活性成分，利用PDB数据库(http://www1.rcsb.org/)检索新型冠状病毒产生的主要蛋白酶(3CLpro)的蛋白结构(PDB：6LU7)。利用Openbabel软件将活性成分由SDF格式文件转换为PDBQT格式文件，作为对接配体；将3CLpro蛋白结构在Pymol中删除配体，在AutoDock软件中进行去水、加氢、计算电荷操作，作为对接受体。利用AutoGrid软件与AutoDock软件进行分子对接，并用Pymol软件将结构可视化。

2 结 果

2.1 活性成分与靶点获取 利用TCMSP数据库检索到热毒宁和血必净中的潜在活性成分：金银花236个，青蒿126个，栀子98个，丹参202个，当归125个，红花189个，川芎189个，赤芍119个。根据口服生物利用度和类药性筛选后，获得潜在活性成分：金银花23个，青蒿22个，栀子15个，丹参65个，当归2个，红花22个，川芎7个，赤芍29个。获得COVID-19靶点1751个，其中热毒宁的药物靶点702个，血必净的药物靶点1049个，去除重复靶点后，获得热毒宁靶点196个，血必净靶点217个。

2.2 COVID-19靶点的获取 利用GeneCards数据库获得COVID-19靶点438个。

2.3 药物-疾病交集靶点的获取 将2.1项下196个热毒宁中药靶点与2.2项下438个疾病靶点进行交集，获得热毒宁和COVID-19的交集靶点51个；将2.1项下217个血必净中药靶点与2.2项下438个疾病靶点进行交集，获得血必净和COVID-19的交集靶点56个。将两部分靶点进行交集，获得51个相同靶点，血必净较热毒宁多5个单独靶点。热毒宁、血必净中药靶点与疾病靶点的维恩图见图1。

2.4 活性成分-疾病靶点网络图 利用Cytoscape 3.6.1软件构建活性成分-靶点网络图 (见图2)， 该图中共有129个节点，330条边。其中蓝色圆形节点51个， 代表热毒宁、血必净的公共靶点； 黄色圆形节点5个，代表血必净独有的靶点；红色方形节点65个，代表血必净独有的活性成分；绿色方形节点24个，代表热毒宁独有的活性成分；紫色方形节点8个，代表血必净与热毒宁共有的活性成分。度值较高的活性成分包括：木犀草素、槲皮素、山奈酚、黄芩素、异鼠李素，其度值分别为43、20、14、9、8；度值较高的靶点包括：PTGS2、PTGS1、NOS2、PPARG、GSK3B，其度值分别为91、47、25、23、18。

图1 热毒宁、血必净中药靶点与COVID-19疾病靶点的维恩图

图2 热毒宁、血必净活性成分与COVID-19的疾病靶点网络图

2.5 蛋白相互作用网络 利用Cytoscape 3.6.1软件构建热毒宁、血必净与COVID-19公共靶点的蛋白相互作用网络图(见图3)，图中有51个节点，690条边。图中的节点越大、颜色越红表明靶点的度值越高，靶点作用越关键。度值排名前10位的靶点是：血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、胱天蛋白酶3(CASP3)、白介素6(IL-6)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK8、ALB、CXCL8、IL-10、CCL2、PTGS2，其度值分别为47、43、43、41、41、40、39、39、38、38。

2.6 KEGG富集分析结果 KEGG富集分析结果表明，热毒宁、血必净与COVID-19交集的公共靶点主要参与了糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、恰加斯病、百日咳、IL-17信号通路、类风湿关节炎等。其中富集程度最高的糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路，包括Jak-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路等(见图4)。

图3 公共靶点的蛋白相互作用网络图

2.7 分子对接 以木犀草素、槲皮素、山奈酚作为对接配体，3CLpro作为对接受体，分子对接结果表明木犀草素与3CLpro的结合能为-1.96 kJ/mol，槲皮素与3CLpro的结合能为-2.30 kJ/mol，山奈酚与3CLpro的结合能为-3.83 kJ/mol。山奈酚与3CLpro的对接能力最强。三种化合物与3CLpro的对接模式图见图5。

3 讨 论

COVID-19主要由新型冠状病毒感染引起，抗病毒是治疗病毒性感染的基本策略，目前研究的抗击COVID-19药物主要是通过3CLpro受体及跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)以抑制病毒侵入、病毒膜融合，或抑制SARS-CoV-2的3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶的活性[4]。现代研究表明，热毒宁注射液有广谱抗病毒作用，可治疗病毒性肺炎、手足口病、疱疹性咽峡炎等多种病毒感染性疾病[5-7]。循证医学研究表明，热毒宁注射液可以缩短病毒性肺炎患者的退热时间、啰音消失时间和咳喘消失时间，提高治疗有效率[8]。血必净注射液和抗病毒药物联合使用也可提高COVID-19患者的治疗效果[9]。热毒宁注射液和血必净注射液有明确的临床疗效，但其物质基础与作用机制尚不明确，利用网络药理学探究其共有的活性物质与作用机制，对临床应用与新药研发具有重大意义。

图4 公共靶点的KEGG富集分析图

图5 化合物与3CLpro (PDB:6LU7)对接作用模式

网络药理学研究发现，热毒宁注射液和血必净注射液公共的且度值较高的靶点包括VEGF-A、CASP3、IL-6。VEGF-A在组织纤维化，内皮细胞的增殖、迁移、存活和血管通透性的维持等多种生理、病理过程中发挥重要作用，COVID-19可导致患者肺纤维化[10]，热毒宁和血必净可能是通过调控VEGF-A抑制肺纤维化，从而改善患者的肺部症状。CASP3与细胞凋亡密切相关，作者推测热毒宁和血必净可能是通过抑制CASP3抑制肺泡细胞的凋亡，从而促进肺功能恢复。IL-6与炎症密切相关，热毒宁和血必净可能是通过抑制炎症反应从而起到解热镇痛、止咳平喘的作用。Jak-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路等可能是热毒宁和血必净作用的相关通路，这些通路主要与炎症反应、细胞凋亡、纤维化相关，提示抑制炎症反应、抑制细胞凋亡、抑制肺纤维化可作为COVID-19的辅助治疗方法。

网络药理学研究表明，热毒宁和血必净共有的成分包括木犀草素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素和植物甾醇等。研究表明，山奈酚和槲皮素具有抗病毒、抗炎、调节免疫、保护脏器的作用[11]。木犀草素对多种病毒的感染具有抑制作用，主要通过影响病毒感染宿主细胞中激酶或转录因子的活性，从而影响病毒的复制和转录；或者直接对病毒产生抑制作用[12]。异鼠李素也具有明确的抗病毒作用，可提高小鼠的抗病毒能力，并提高小鼠病毒感染后的生存率[13]。进一步的分子对接实验结果表明，槲皮素、木犀草素、山奈酚和3CLpro具有一定的结合能力，但其结合能较弱，这也证实了黄酮类小分子化合物具有多靶点但作用弱的特点，这提示在日后的应用过程中应当提高黄酮类化合物的剂量，从而提高临床疗效。此外，大量研究表明植物甾醇可以参与免疫调节并发挥抗炎作用，降低促炎细胞因子的含量，结合网络药理学研究结果，提示其主要是通过抑制炎症反应而改善COVID-19患者的症状[14]。

综上所述，热毒宁和血必净由于组方差异，在抗COVID-19靶点方面既有相同也有不同。本研究通过对VEGF-A、CASP3、IL-6、MAPK1、MAPK8等共有靶点阐释COVID-19“同病异治”中的“同病”，通过对NPM1、STAT3、CAT、APOD、CD14特有靶点阐释COVID-19“同病异治”中的“异治”。上述预测靶点与已有文献报道的药理作用相吻合，表明预测靶点的准确性。此外，关于上述讨论中剩余靶点的相关研究报道较少，这可为今后深入研究抗COVID-19潜在靶点的分子作用机制提供线索。