LSS和HMGCR基因的单核苷酸多态性与年龄相关性白内障的关系

邹 茜，邓国华，张 骏，顾珊珊，戎 晗，康丽华，王 勇，管怀进

0引言

年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)是我国乃至全球范围内首位致盲性眼病[1-2]。ARC的病因和发病机制至今仍不清楚，许多研究表明胆固醇代谢异常可能与白内障发生发展相关[3-4]。研究发现，胆固醇的上游底物羊毛甾醇可以减少晶状体的蛋白质聚集，减少白内障的形成[5-7]。羊毛甾醇的合成过程中最关键的限制酶是羊毛甾醇合成酶(LSS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)[8-12]。前期研究表明DNA修复基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与ARC相关[13-14]。在本研究中，我们选择了LSS和HMGCR基因的4个SNP位点(rs2968，rs9980968，rs12916，rs17238484)，并进行了病例对照研究，以探讨这4个SNP与ARC之间的关系。

1对象和方法

1.1对象流调人群选择2014年江苏眼病启东县及阜宁县研究基地[15]。晶状体混浊程度按LOCSⅢ分级系统进行分级[16]。ARC入选标准：(1)晶状体混浊；(2)最佳矫正视力<0.5；(3)年龄≥50岁。排除标准：(1)糖尿病、葡萄膜炎、青光眼、高度近视、眼部外伤或者其他原因所引起的白内障；(2)双眼中有一眼为无晶状体眼。

对照组的入选标准：(1)晶状体透明；(2)最佳矫正视力>0.5；(3)年龄≥50岁。排除标准：(1)患有葡萄膜炎、青光眼、近视、晶状体脱位、黄斑疾病等其他眼病；(2)患有糖尿病、癌症、肾脏疾病、自身免疫病等全身性疾病。并且要求对照组与ARC组患者性别及年龄均匹配。在知情同意的情况下，采集外周静脉血。本研究通过南通大学附属医院伦理委员会批准。所有人群均被告知研究意义并签订了知情同意书。流调人群研究对象一般资料见表1。

表1 流调人群对照组与ARC组一般资料

本研究还从常州市第三人民医院眼科2018-08/2019-08住院期间选取了40例ARC患者(皮质型、核型、后囊下型、混合型各10例)和10例进行晶状体摘除+玻璃体切除术的囊膜透明患者。两组无年龄、性别差异(P>0.05)。在知情同意的情况下，手术时收取晶状体囊膜[含晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)]，用以测量LECs的目标基因mRNA表达量。研究通过常州市第三人民医院伦理委员会批准。研究对象一般资料见表2。纳入标准和排除标准同流调人群。

表2 住院人群对照组与ARC组一般资料

1.2方法

1.2.1外周血DNA提取采用苯酚/氯仿/异戊醇法提取外周血中基因组DNA，并用Nanodrop测定所有血样DNA浓度和纯度，取OD260/OD280比值1.6～1.9纯度要求的DNA。将DNA浓度稀释到50μg/mL，登记后放入-20°C冰箱保存备用。

1.2.2筛选相应SNPs通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)选取LSS及HMGCR的SNPs，所选位点满足在北京的中国汉族人群中最小等位基因频率(MAF)≥10%，并且利用在线工具(http://www.broadinstitute.org/mpg/snap)排除高度连锁不平衡(r2≤0.8)4个SNPs位点，见表3。

表3 SNPs位点信息

1.2.3检测基因型采用TaqMan RT-PCR法对所有SNPs位点进行检测。TaqMan探针是一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。每个SNPs位点分别以双探针(VIC和FAM)荧光信号判定目的基因所含的野生位点和变异位点，在PCR反应过程中，探针携带的荧光释放，目的基因扩增，相应荧光强度增加，PCR仪器通过实时荧光探测系统探测不同波长荧光的强度，并随时报告扩增图谱，从而对基因分型结果进行识读。用96孔板体外扩增，每次检测设4孔为空白对照。

1.2.4 LECs中RNA的提取及cDNA的制备行白内障超声乳化吸除术时，撕取5mm直径的晶状体中央前囊膜(含LECs)，用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)从晶状体囊膜中提取总RNA。用Narodrop测定OD260/OD280值(1.7

1.2.5 qRT-PCR法检测LECs中LSSmRNA表达量选取LSS(assay ID:Hs01552331_m1)，以人GAPDH(Hs02786624_g1)作为内参，加入TaqMan Expression Master Mix(Thermos fisher)，用ABI公司的step-one型实时PCR仪分析，通过检测荧光信号，比较LSS和内参基因的Ct值，最后用2-ΔΔCt分析相关基因的表达情况。该实验对每个样本重复做3次。

统计学分析：采用Stata 17.0和Stata Corp统计软件程序进行统计分析。使用HaploView4.2软件进行连锁不平衡分析。采用独立样本t检验比较对照组和ARC组的年龄差异；采用卡方检验比较其性别差异。采用卡方检验分析对照组和ARC组及各型ARC组的等位基因频率之间的关联，并计算各基因型的哈迪-温伯格平衡。当等位基因分析中发现任何阳性结果时，用Bonferroni校正进一步对结果进行校正，以Pa作为Bonferroni校正值。采用单因素方差分析来计算进行qRT-PCR检测结果的组间比较，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1对照组和ARC组基因SNPs位点基因型分布流调人群对照组和ARC组SNPs等位基因频率分布LSS基因rs2968位点，对照组稀有等位基因占30.31%，ARC组占26.32%，差异有统计学意义(P=0.018)；但是Bonferroni校正后差异消失(P=0.072)。LSS基因rs9980968位点，对照组稀有等位基因占16.48%，ARC组占14.03%，差异无统计学意义(P>0.05)；MHGCR基因rs12916位点，对照组稀有等位基因占42.80%，ARC组占44.72%，差异无统计学意义(P>0.05)；MHGCR基因rs17238484位点，对照组稀有等位基因占32.81%，ARC组占31.32%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 SNPs位点基因型分布

分层分析后发现LSS基因rs2968位点，与核型ARC的等位基因频率差异有统计学意义(P=0.003)，其中A等位基因为易感基因。Bonferroni校正后差异依然存在(P=0.012)；与皮质型、后囊下型、混合型均无明显统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 LSS-rs2968与各型ARC之间的关系%

2.2对照组和各型ARC患者LECs中LSS表达差异住院人群ARC组各亚型的LECs中LSS的mRNA表达均低于对照组(P<0.05)，各型ARC组间比较无差异，见图1。

图1 对照组及ARC前囊膜样本中LSS mRNA的表达 各型ARC组晶状体前囊膜样本中LSS mRNA比对照组均低。aP<0.05 vs对照组。

3讨论

ARC的病因和发病机制至今仍不清楚。研究表明，基因与环境因素之间的相互作用，包括胆固醇代谢、年龄、性别、紫外线、氧化应激等，都与ARC有关[3,10,13,17]。研究发现，胆固醇的上游底物羊毛甾醇可以减少晶状体的蛋白质聚集，减少白内障的形成[5-6]。羊毛甾醇和25-羟基胆固醇是两种机制上不同的抗白内障药物先导化合物[18]。但目前尚未找到合适的溶剂溶解羊毛甾醇[5]。羊毛甾醇的合成是一个复杂的过程，涉及20多个步骤[8-12]，其中最关键的限制酶是LSS和HMGCR[9,12]。LSS是羊毛甾醇合成酶，又称环氧角鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)，是在生物界普遍存在的一类酶，参与动植物的多项生理活动，具有调节脂类代谢的生理功能[9,11,19]。HMGCR催化HMGCoA生成甲羟戊酸，是胆固醇合成途径中关键的限速步骤[10,12]。我们推测LSS和HMGCR可能与ARC发生发展相关。

已有研究表明抑制LSS活性可诱导大鼠晶状体混浊，若同时加入羊毛甾醇能有效地延迟晶状体混浊的发生[20]。LSS能在晶状体上皮细胞的变性和凋亡的早期阶段起保护作用来预防白内障[9]。研究表明20号染色体上的LSS可能是具有遗传性白内障特征的大鼠发生白内障的主要致病基因[21]。研究发现，LSS的遗传变异与慢性肾脏损伤[22]以及神经外胚层综合征[23]有关。Zhao等[5]在先天性白内障的LSS基因上发现了突变位点(W581R和G588S)，后又有人报道了先天性白内障患者的LSS基因存在突变[24]，证实LSS可能与人类白内障的发生有关，因此我们进一步推测LSS和HMGCR的遗传变异可能与ARC有关。SNP是人类基因组中最丰富的一种遗传变异形式，存在于DNA的任何区域，包括内含子、编码区和非翻译区[25]。我们也报道了DNA修复基因中的SNPs与ARC相关[13-14]。在本研究中，我们选择了LSS和HMGCR的4个SNPs，并发现LSS-rs2968与核型ARC相关，其中A等位基因为易感基因。研究表明，LSS在大鼠和人白内障晶状体中的表达均呈下降趋势[20-21]。在本研究中，我们发现与对照组相比，所有ARC亚型的LECs中LSS的表达均下降。

综上所述，我们的结果表明，LSS-rs2968基因可能影响汉族人群核型ARC的易感性。与对照组相比，所有ARC亚型的LSS表达均下降。但我们还没有解释LSS-rs2968与ARC的易感性相关以及ARC患者LECs中LSS下降之间的联系。rs2968位于LSS基因的3’-UTR区，可能该SNP改变了LSS与微小RNA(miRNAs)的结合。在可能的情况下，未来的研究应继续进行流行病学调查，扩大流行病学人群样本量，以探索SNPs和ARC之间的关系。另外我们将继续收集临床患者样本并进行基因型检测，阐明不同基因型的患者之间LECs中是否存在LSS的表达差异，并进一步通过生物信息学分析和其他实验阶段解释两者之间的相关机制。