豌豆蛋白质提取工艺优化及其乳化性和起泡性研究

戴 媛，冷进松，陆红佳

（重庆文理学院园林与生命科学学院/特色植物研究院，重庆 402160）

豌豆（Pisum sativumLinn），别称有麦豌豆、寒豆、麦豆、雪豆、毕豆、麻累、国豆等。原产于地中海南部及地中海沿岸，是一种营养性食品［1］。豌豆种子富含蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、维生素和矿物质等［2］，其中蛋白质含量达 20.6%［3］，豌豆蛋白质具有优良的理化特性，可广泛应用于食品中，如具有较好的溶解性，可添加于饮料中；具有一定的发泡性能和泡沫稳定性，可部分代替蛋类添加到糕点制品中；具有较好的乳化性和乳化稳定性，可用作各类食品的乳化剂［4］。但是，目前对于豌豆蛋白质理化特性的研究较少，在食品领域的应用也受到限制。因此，系统地研究豌豆蛋白质的理化特性，有助于豌豆蛋白质的深加工和综合利用，也为豌豆蛋白质的产业化应用奠定基础。

目前，国内外提取豌豆蛋白质的方法主要分为物理法（超滤膜法［5］、超声波提取［6］）、化学法（盐析法、沉淀法［7］）和生物学法（酶水解法［8］）3 种方法。将超声波提取技术与酶水解2 种提取方法有机结合，也就实现了物理法与生物学法之间的结合，进而得到一种具有提取率高、提取时间短、工作效率高等优点的超声辅酶法。

本研究采用超声辅酶法提取豌豆蛋白质，设置合理的工艺条件确定最佳工艺参数，使豌豆蛋白质提取工艺得到优化，提高豌豆蛋白质提取率，并测定提取产物豌豆蛋白质的乳化性和起泡性，为豌豆蛋白质的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 豌豆（网络购买），产于河南商丘；大豆油，市售（益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司）。

1.1.2 试剂 各种蛋白酶，均购自浙江博南生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250，购自上海远慕生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），购自合肥巴斯夫生物科技有限公司；牛血清蛋白，购自苏州达麦迪生物医学科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 UV 2600 型紫外可见分光光度计，上海天美科技科学仪器有限公司；TG16W 高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；SB-5200 DTDN 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RRH-250 型高速多功能粉碎机，上海缘沃工贸有限公司；KDN-102C 凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；SCIENTZ-150 高压均质机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豌豆蛋白质提取的工艺流程 干豌豆→粉碎成粉→加水混匀→加酶→调节溶液pH（酶的最适pH）→在超声波辅助提取下提取一定时间→100 ℃水浴，灭酶10 min→6 000 r/min 离心15 min→去掉上层的脂肪结块和下层沉淀→收集中间的清液→分光光度计测吸光度→计算蛋白质含量。

1.2.2 豌豆基础成分的测定 水分采用常压干燥法，参照 GB/T5009.3—2016［9］；蛋白质采用凯氏定氮法，参照 GB/T5009.5—2016［10］。

1.2.3 蛋白质含量测定

1）绘制标准曲线。以牛血清白蛋白为标准样品，采用考马斯亮蓝法测定其含量，以吸光度（A）为横坐标，蛋白质浓度（μg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线［11］。

2）蛋白含量测定。取0.3 mL 提取液于试管中，0.15 mol/L 的氯化钠溶液定容至1.00 mL，加5.0 mL考马斯亮蓝溶液后摇匀，在595 nm 的波长下测定吸光度。与标准曲线对比，计算蛋白质含量［12］。

1.2.4 单因素试验 采用“1.2.1”的方法提取蛋白质，固定提取条件为碱性蛋白酶、提取时间50 min、超声波功率150 W，考察不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g∶mL，下同）对豌豆蛋白质提取率的影响；固定提取条件为碱性蛋白酶、料液比1∶30、超声波功率150 W，考察不同提取时间（20、30、40、50、60 min）对豌豆蛋白质提取率的影响；固定提取条件为料液比1∶30、超声波功率150 W、提取时间50 min，考察酶的种类（碱性蛋白酶、风味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶）对豌豆蛋白质提取率的影响；固定提取条件为碱性蛋白酶、料液比1∶30、提取时间50 min，考察超声波功率（60、90、120、150、180 W）对豌豆蛋白质提取率的影响。

1.2.5 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 软件的Box-Behnken 试验设计原理，以豌豆蛋白质提取率为响应值（Y），以料液比（A）、提取时间（B）、酶种类（C）、超声波功率（D）为自变量，设计四因素三水平响应面分析试验，以优化豌豆蛋白质提取工艺。因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

1.2.6 乳化性和起泡性测定 取最佳工艺条件下制得的蛋白质提取液，测定其乳化性和起泡性。

1）乳状液的准备。用 0.2 mol/L，pH 为 7.0 的磷酸盐溶液配制1%（m/V，下同）豌豆蛋白质溶液，取30 mL 蛋白质溶液于100 mL 烧杯中，加入大豆油10 mL，用均质机将混合溶液以5 000 r/min 的速度均质2 min，制得乳状液待用［13］。

2）乳化性测定。分别在0、10 min 时用微量移液器吸取底部乳状液50 μL，加入25 mL 的0.1%（m/V）SDS 溶液混合均匀（稀释500 倍）。以相同的SDS 溶液作空白对照，立即测定其在500 nm 处的吸光度［14］。乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）的计算公式如下：

式中，A0为均质后迅速被稀释的乳化液的吸光度；C为乳状液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度（g/mL）；Φ为乳状液中油的体积分数（1/4）。

式中，A0为均质后迅速被稀释的乳化液的吸光度；A10为乳状液在静置10 min 后的吸光度；t为时间（10 min）。

3）起泡性测定。用 0.2 mol/L、pH 为 7.0 的磷酸盐溶液配制1%豌豆蛋白质溶液，用移液管取40 mL于100 mL 小烧杯中，用均质机以5 000 r/min 的速度均质2 min，立即转入量筒中，分别记录均质停止和30 min 之后的泡沫体积V1、V2［15］。起泡能力（FAI）和泡沫稳定性（FSI）的计算公式如下：

式中，V1为均质停止时的泡沫体积。

式中，V1为均质停止时的泡沫体积；V2为均质停止30 min 后的泡沫体积。

1.3 数据统计分析

采用 Microsoft Excel 2007、Design Expert 8.0.6 软件进行数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 豌豆基础成分的测定结果

豌豆中水分和蛋白质的含量分别为9.12%、20.60%。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对豌豆蛋白质提取率的影响 如图1所示，随着料液比的不断减小，豌豆蛋白质提取率不断增大，当料液比在1∶30 时，提取率达到最大，主要是由于溶剂与样品接触面浓度差变大，引起渗透压增大，更有利于溶质的渗出，最终得到蛋白质提取率不断升高［16］；随后料液比减小，提取率下降，主要是由于随着料液比的不断减小，提取液中蛋白质浓度降低，增加了蛋白质的提取难度。因此，选择料液比1∶25、1∶30、1∶35 进行响应面优化试验。

图1 料液比对豌豆蛋白质提取率的影响

2.2.2 提取时间对豌豆蛋白质提取率的影响 如图2 所示，随着提取时间的增加，豌豆蛋白质提取率呈先上升后下降的变化趋势，在提取时间为50 min 时，蛋白质提取率达到最大。主要由于提取时间增加，溶质的溶解度逐渐增大，酶与蛋白质充分反应，当达到一定时间后，溶质的溶解度达到最大，且酶活性降低，进而蛋白质的提取达到最大限度，不再溶出蛋白质［17］。因此，选择提取时间 40、50、60 min 进行响应面优化试验。

图2 提取时间对豌豆蛋白质提取率的影响

2.2.3 酶种类对豌豆蛋白质提取率的影响 如图3所示，不同种类的酶对蛋白质提取率的影响不同，其影响程度为碱性蛋白酶＞风味酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶。其中，利用风味酶和碱性蛋白酶提取样品得到的蛋白质提取率较高，并且两者的提取效果差别较小，酸性蛋白酶提取样品中的蛋白质提取率最低，这是因为风味酶和碱性蛋白酶在提取时的最适pH 偏碱性，蛋白质在碱性溶液中溶解度大，得到较好的提取效果［18］，而酸性蛋白酶的最适pH 偏酸性，在4.5 左右，此pH 在蛋白质的等电点附近，导致蛋白质不容易析出，得到的蛋白质提取率偏低［19］。因此，选择碱性蛋白酶、风味酶和木瓜蛋白酶进行响应面优化试验。

图3 酶种类对豌豆蛋白质提取率的影响

2.2.4 超声波功率对豌豆蛋白质提取率的影响 如图4 所示，随着超声波功率的增大，豌豆蛋白质提取率先增加后下降，在超声波功率为150 W 时，提取率达到最大。这是因为超声波的功率增加，其空化效应和机械效应就愈加明显，作用更加强烈［20］，将植物细胞壁进一步破碎，增大蛋白质溶出速率，进而使蛋白质更易溶出。但超声波功率大于150 W 后，超声波作用则会引起蛋白质的变性，最终会影响蛋白质的提取率［21］。因此，选择超声波功率 120、150、180 W 进行响应面优化试验。

图4 超声波功率对豌豆蛋白质提取率的影响

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计及结果 在单因素试验结果的基础上，以豌豆蛋白质提取率为响应值（Y），以料液比（A）、提取时间（B）、酶种类（C）、超声波功率（D）为自变量，应用Design Expert 8.0.6 统计分析软件设计试验方案及结果，如表2 所示。

2.3.2 回归模型拟合及方差分析 利用统计软件对表3 数据进行多元回归拟合，得到提取率（Y）与自变量之间的回归方程，即：Y=94.84+4.05A+1.52B+0.97C-0.34D-0.023AB-0.012AC-3.17AD-0.017BC+0.050BD+0.35CD-15.25A2-9.84B2-6.81C2-3.35D2。

由表3 可知，回归模型P＜0.000 1，表明该回归模型极显著；模型的相关系数R2=0.962 5，表明模型的拟合值与实际结果的相关性较高；失拟项不显著（P＞0.05），说明回归方程拟合较好，模型稳定；变异系数值CV=4.69%＜10.00%，进一步说明模型拟合较好，可用来进行分析和预测。

由F可知，4 个因素对响应值影响的大小顺序为A＞B＞C＞D，其中，一次项A和交互项AB，以及二次项A2、B2、C2、D2对响应值的影响极显著（P＜0.01），一次项B和交互项AC、AD对响应值的影响显著（P＜0.05）。

2.3.3 响应面分析 两因素之间的交互作用对应值的影响可以通过响应面图反映出来，响应曲面坡度越陡峭，说明因素的改变对于响应值的影响越大，而曲面坡度越平滑，说明因素的改变对响应值的影响也就越小［22］。图5 为料液比与提取时间、料液比与酶种类、料液比与超声波功率、提取时间与酶种类、提取时间与超声波功率、酶种类与超声波功率之间的交互作用对豌豆蛋白质提取率的影响。从图5 中可以看出，图5a 曲面坡度最陡峭、图5b 和图5c 曲面坡度较陡峭，而图5d、图5e 和图5f曲面坡度较平滑，说明料液比与提取时间的交互作用对豌豆蛋白质提取率的影响最明显，其次是料液比与酶种类的交互作用、料液比与超声波功率的交互作用的影响，而提取时间与酶种类、提取时间与超声波功率、酶种类与超声波功率的交互作用对豌豆蛋白质提取率的影响不明显，此结果与方差分析结果一致。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

2.3.4 验证试验 对回归方程进行分析求解，得到豌豆蛋白质提取率达到最大值时的提取条件为料液比1.00∶30.51，添加碱性蛋白酶，提取时间50.22 min，超声波功率150.98 W，此条件下的提取率预测值为95.04%。为方便试验操作，将提取条件定为料液比1∶30，添加碱性蛋白酶，提取时间50 min，超声波功率150 W，在此条件下进行验证试验，得到豌豆蛋白质提取率为95.64%，预测误差为0.63%，与预测值接近。说明此模型可以用于豌豆蛋白质提取条件的分析预测，响应面法也可以有效地优化豌豆蛋白质的提取工艺条件。

2.4 乳化性和起泡性试验

2.4.1 乳化性测定结果 豌豆蛋白质提取物的乳化活性随浓度变化趋势如图6 所示。由图6 可以看出，EAI呈先上升后下降的趋势，当蛋白质浓度在1%～3%时，随着浓度的升高，EAI上升；当浓度达到3%时，EAI达到最大值11.27 mL/g，之后随着浓度的增大，EAI也下降。说明豌豆蛋白质具有较好的乳化活性，且发挥最佳乳化活性浓度为3%。

图5 两因素交互作用对豌豆蛋白质提取率的影响

图6 豌豆蛋白质浓度对EAI的影响

豌豆蛋白质提取物的乳化稳定性随浓度变化趋势如图7 所示。由图7 可以看出，当蛋白质浓度在1%～3%时，ESI呈上升趋势，且在浓度为3%时达到最大值36.96 min；当蛋白质浓度超过3%时，ESI下降，这是因为在一定的蛋白质浓度范围内，高浓度有利于油相的分布，同时也增加了其黏度［23］，所以乳化活性及乳化稳定性均理想，但达到一定平衡后继续增加黏度却破坏了体系的平衡，以致乳化性降低。因此，蛋白质浓度3%为最佳条件，对ESI的效果最好。

图7 豌豆蛋白质浓度对ESI的影响

2.4.2 起泡性测定结果 豌豆蛋白质提取物的起泡能力随浓度变化趋势如图8 所示。由图8 可以看出，当蛋白质浓度在1%～3%时，FAI呈上升趋势，且在浓度为3%时达到最大值86.25%；当蛋白质浓度在3%～5%时，FAI呈下降趋势，这是因为在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质浓度增大，溶液黏度也增大，有利于泡沫的形成，但当浓度过大时溶液黏度也过大，不利于泡沫的形成。因此，蛋白质浓度3%为最佳条件，对FAI的效果最好。

图8 豌豆蛋白质浓度对FAI的影响

图9 为豌豆蛋白质提取物的泡沫稳定性随浓度的变化趋势。由图9 可以看出，当蛋白质浓度在1%～3%时，FSI呈上升趋势，且在浓度为3%时达到最大值33.33%；蛋白质浓度在3%～5%时，FSI呈下降趋势。因此，蛋白质浓度3%为最佳条件，对FSI的效果最好。

图9 豌豆蛋白质浓度对FSI的影响

3 小结

本研究采用超声辅酶法从豌豆中提取蛋白质，在单因素试验的基础上，应用响应面分析法优化豌豆蛋白质的提取工艺，并得到豌豆蛋白质提取的最佳工艺条件为料液比1∶30，添加碱性蛋白酶，提取时间50 min，超声波功率150 W，在此条件下得到豌豆蛋白提取率为95.64%，预测值为95.04%，预测误差较小，说明采用响应面方法优化豌豆蛋白质提取工艺可行，此结果为今后对豌豆蛋白质的进一步研究奠定了理论基础。

乳化性和起泡性试验结果表明，豌豆蛋白质具有较好的乳化活性和乳化稳定性以及较好的起泡能力和泡沫稳定性，其中，乳化活性和乳化稳定性的最大值分别为11.27 mL/g、36.96 min；起泡能力和泡沫稳定性的最大值分别为86.25%、33.33%，此结果可为豌豆蛋白质在食品及医药保健品等领域的开发利用提供一定的借鉴。