商业酵母在葡萄酒工业化生产中的定殖情况分析

孙悦，杨慧敏，何荣荣，张军翔

商业酵母在葡萄酒工业化生产中的定殖情况分析

1宁夏大学食品与葡萄酒学院，银川 750021；2西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100

【】揭示商业活性干酵母（active dry yeast，ADY）在葡萄酒工业生产中的定殖情况，及其与我国本土酿酒酵母菌株的遗传关系，为我国本土优良酿酒酵母的选育提供理论依据，同时为葡萄酒生产中ADY的使用提供参考。以宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的‘赤霞珠’葡萄为原料，分别接种BDX、XR、FR和FX10四种ADY发酵，于接种后的1、3和5 d取样。利用Interdelta和SSR技术对酿酒酵母进行菌株区分，分析商业ADY在不同发酵阶段的数量、比例以跟踪其定殖能力。利用PopGen32软件分析其遗传多样性相关指数，采用NTsys2.10e软件揭示商业酵母与宁夏本土酵母的遗传关系。4种ADY共显示出6种Interdelta指纹图谱即6种基因型：XR和FR均由2种株系组成，BDX和FX10均由1种基因型组成。对于本研究选取的9个微卫星位点而言，每种ADY均显示出1种基因型。4个发酵中共分离到225个酿酒酵母单菌落，Interdelta分析显示42种基因型，其中本土基因型为36种，菌株变异程度为中等16%（36/225）；SSR分析显示20种基因型，其中本土基因型为16种，处于中等遗传多样性水平。9个微卫星位点共检测出75个等位基因，平均每个位点的等位基因数为8.3333个，观测杂合度（Ho）在0.2000—0.5000，PIC在0.6339—0.8620，平均值为0.7614，均为高度多态性位点。接种BDX的发酵中本土基因型最丰富（11种Interdelta类型和8种SSR类型），接种FR的发酵次之（11种Interdelta类型和6种SSR类型）。商业ADY没有在发酵的各个阶段占据主导地位，对于不同的发酵阶段而言，优势酿酒酵母的基因型也存在差异。Interdelta分析和SSR分析均显示FR不是相应发酵中的优势菌株。BDX虽然存在于整个发酵过程中，但只在接种后的3 d占主导地位。接种XR和FX10的发酵中，Interdelta分析法显示它们不是发酵中的主导菌株，而SSR分析显示它们均是相应发酵中的主导菌株。本土酿酒酵母基因型β（SSR类型为BDX-7）、基因型γ（SSR类型为BDX-6）、基因型A（SSR类型为XR）、基因型a（SSR类型为FX10）、基因型b（SSR类型为FX10）、基因型bb（SSR类型为FR-2）和基因型ee（SSR类型为FR-4）等在相应的发酵中均表现出较强的竞争力。聚类分析表明，分离自相同发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较大。葡萄酒工业生产中本土酿酒酵母基因型丰富，发酵是由本土酵母与商业酵母共同参与完成的，且二者在发酵中相互竞争，数量动态演替。

活性干酵母；接种发酵；菌株区分；葡萄酒；微卫星

0 引言

【研究意义】酵母菌在葡萄酒酿造过程中起着重要的作用，酵母菌是将糖转化为酒精、二氧化碳以及多种次级代谢产物的主要微生物。目前，我国葡萄酒生产企业大都使用接种商业化的活性干酵母（active dry yeast，ADY）进行葡萄酒的酿造与生产，利用商业ADY酿造葡萄酒可以缩短迟滞期，使酒精发酵过程得到有效控制，从而提高葡萄酒质量，实现产品质量的均一化。但是，由于本土酿酒酵母在酒精发酵过程中表现出较强的竞争能力，接种的ADY在酒精发酵过程中的主导地位得不到保证[1-2]。长期使用ADY可能导致我国本土微生物多样性受减和葡萄酒同质化的后果。酿酒酵母是决定葡萄酒最终质量的重要因素之一，不同酿酒酵母菌株的代谢产物存在差异，因而会影响葡萄酒的风味和独特性。因此，对葡萄酒工业生产过程中酿酒酵母菌株多样性进行监控，分析发酵过程中不同酵母菌株的数量优势关系，对于发酵过程的有效控制及提升我国葡萄酒质量具有重要意义。【前人研究进展】近年来，随着分子生物学技术及不同世代测序技术的深入发展，实现了酿酒酵母菌株水平上的区分，如核型分析法、微卫星DNA标记法（SSR）、单核苷酸多态性（SNP）、随机扩增多态性DNA标记法（RAPD）、线粒体DNA限制性片段长度多态性分析（mtDNA-RFLP）、Interdelta指纹图谱法以及COX1基因指纹图谱法等。ADY在葡萄酒工业生产中的定殖情况在西班牙[2-4]、意大利[5]、加拿大[6]等国家已有相关报道。Gil-Díaz等[1]对西班牙马德里葡萄酒产区的30个工业发酵进行了分析，结果表明接种的ADY在整个发酵过程中的优势地位得不到保证，只有9个发酵中ADY的占比达到80%以上，而在16个发酵中接种的ADY占比低于50%。Lange等[6]比较了加拿大不列颠哥伦比亚省3个酒厂的ADY定殖情况及其在整个发酵中的持久性，发现ADY的定殖能力以及在发酵中的持久性存在明显的逐年变化；但没有发现明显的影响商业酵母在发酵中所占比例的因素。葡萄酒生产中，ADY不占主导地位的原因主要包括接种方法不规范[2,7]、发酵工艺操作影响[7-8]以及ADY与本土酵母间的互作[1-2]等3个因素的影响。ADY与我国本土酿酒酵母在发酵过程中的竞争关系，以及对我国本土酿酒酵母菌株多样性的影响少见报道。何娟等[9]对贵人香冰酒生产中酵母菌群结构及动态变化进行了研究，结果表明商业酵母LVCB在整个发酵过程中一直处于主导地位。宋育阳等[10]以宁夏‘黑比诺’葡萄为原料，研究接种商业酵母RC212发酵中酿酒酵母菌株动态变化时发现，发酵初期和中期本土酿酒酵母占主导地位，而RC212只在发酵后期占主导地位。【本研究切入点】宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区位于东经105°45′—106°47′，北纬37°43′—39°23′，为贺兰山东麓洪积倾斜平原与黄河冲积平原交汇地带，属于中温带干旱气候区[11]。该产区生境特殊，蕴含着丰富的本土微生物菌资源，为葡萄酒酿造创造了优越的条件。但该产区葡萄酒工业生产中ADY与本土酿酒酵母在发酵过程中的竞争关系，以及对本土酿酒酵母菌株多样性的影响尚无全面、系统的监控。【拟解决的关键问题】以‘赤霞珠’葡萄为原料，通过对其接种发酵过程中的3个时期分离的酿酒酵母菌株遗传多样性及亲缘关系进行分析，揭示商业ADY（BDX、XR、FR和FX10）在酒精发酵中的地位，及其与本土酿酒酵母菌株间的数量竞争关系，为选育优良本土酿酒酵母菌株，生产具有地域特色葡萄酒奠定研究基础。

1 材料与方法

试验于2018年在宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的4个葡萄酒酒庄进行。

1.1 材料

1.1.1 葡萄原料 ‘赤霞珠’：糖225—247 g∙L-1，总酸4.4—6.5 g∙L-1（以酒石酸计）。

1.1.2 菌株来源 ‘赤霞珠’葡萄酒工业生产过程中分离的225个酿酒酵母单菌落。

1.1.3 商业ADY XR、FX10、FR（LAFFORT法国拉氟德公司）；BDX（ENOFERM法国莱蒙特公司）。

1.1.4 WLN营养琼脂培养基（Wallerstein Laboratory Nutrient Agar Medium） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ADY单菌落分离 取1 g商业ADY于1 mL无菌水中活化0.5 h，然后划线接种于WLN培养基上，于培养箱中28℃培养4—5 d后记录菌落颜色和形态。每种ADY从WLN培养基上随机挑取10个单菌落进行划线纯化（共计40个单菌落），然后在YPD液体培养基中活化24 h后，与40%的无菌甘油以1﹕1混合保藏在-80℃冰箱中备用。

1.2.2 发酵工艺 以宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的‘赤霞珠’葡萄为原料，分别进行接种4种不同ADY葡萄酒的工业化生产，接种BDX、XR的发酵体积为700 L，接种FR和FX10的发酵体积为7 000 L。发酵工艺按照干红葡萄酒工艺进行：葡萄→手工穗选，除去成熟度不佳的果穗及杂物→除梗、破碎，添加焦亚硫酸钾40—60 mg∙L-1→入罐，添加果胶酶20—30 mg∙L-1→接种商业ADY（接种量为20 g∙L-1），分别于接种后的1、3和5 d取样，5—6℃浸渍3 d→回温→酒精发酵（发酵温度26—28℃），每隔8 h进行淋帽处理15 min→7—9 d酒精发酵结束→皮渣分离、压榨。

1.2.3 发酵过程中酵母菌的分离 接种后1、3和5 d分别取样，所取样品为葡萄酒生产工艺过程中压帽后的均匀样品。样品稀释后涂布于WLN培养基，28℃下培养5—7 d后随机挑取20个酵母单菌落（菌落颜色乳白色至浅绿色，菌落表面光滑，呈乳头状凸起）进行划线纯化，于YPD液体培养基中活化后保存于20%甘油中，-80℃备用。

1.2.4 酵母菌的鉴定 酵母菌的DNA提取方法参考孙悦[12]的方法，酿酒酵母的鉴定参照SUN等[13]的方法。

1.2.5 Interdelta分型及聚类分析 根据所得图谱中PCR产物的个数和长短来进行不同酿酒酵母菌株的区分。本研究选用引物delta12（5′-TCAACAATG GAATCCCAAC-3′）和delta21（5′-CATCTTAACAC CGTATATGA-3′）进行扩增。Interdelta分析的PCR体系、电泳条件及数据处理参照文献[13-14]。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸80 s，循环36次；72℃保温8 min。

1.2.6 SSR分型分析 结合前人研究[15-18]，本研究筛选位点多态性高及使用频率较高的9个微卫星位点，SSR分析采用的位点及引物信息如表1。

PCR反应体系：总体积25 μL，包含10 μmol∙L-1引物（表1）各1 μL，10 μmol∙L-1dNTP 1 μL，10×Taq Buffer（with MgCl2）2.5 μL，5 U∙μL-1Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，13 μL超纯水。

表1 本研究中微卫星位点信息

PCR扩增程序：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环； 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃总延伸7 min。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳确认后委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行毛细管电泳分析，对结果中小数部分的处理采用四舍五入的方法。对于不同的酿酒酵母菌株而言，PCR产物的大小存在差异，9个位点会产生多个不同大小片段的组合，因此可以实现不同菌株的区分。利用PopGen32软件统计微卫星基因座的等位基因数、等位基因频率、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量等[19]，在计算等位基因时，1个核苷酸的差异被认为是相同的[20]。利用NTsys2.10e软件计算每个菌株间的Jaccard相似性系数，用UPGMA算法构建菌株聚类图。

2 结果

2.1 4种ADY的Interdelta指纹图谱及SSR分析

利用Interdelta指纹图谱技术对4种商业酵母BDX、XR、FR、FX10进行基因分型。结果表明，分离保存的40个商业酿酒酵母单菌落（每种ADY随机挑取10个单菌落）共显示出6种Interdelta指纹图谱，即6种基因型（图1）。BDX、FX10分别由1种基因型即1种株系组成；XR和FR分别由2种基因型即2个株系组成。此外，选取9个微卫星位点（表1）利用SSR分子标记技术对上述4种ADY进行分析，9个位点的SSR分析结果如表2所示，4种ADY显示出4种基因型，即每种ADY各表现为1个株系即1种基因型。

FR1、FR2和XR1、XR2分别代表相应ADY的不同基因型

表2 4种ADY的SSR分析结果

2.2 宁夏本土酿酒酵母的Interdelta分型及SSR分析

对分别接种BDX、XR、FR和FX10四种ADY的‘赤霞珠’葡萄酒发酵中分离的酿酒酵母进行菌株多样性分析，通过对接种后1、3和5 d分离的225个酿酒酵母单菌落进行Interdelta分型，以商业酵母的Interdelta图谱为对比，本土酿酒酵母共显示出36种基因型，如图2所示。根据Torija等[21]建议，以菌株数量与分析的单菌落总数的比例计算菌株变异程度，本研究中的菌株变异程度为中等16%（36/225）。接种BDX的发酵中，共分离到50个酿酒酵母单菌落，检测到11种（α—ρ）本土基因型；接种XR的发酵中，共分离到55个酿酒酵母单菌落，检测到6种（A—F）本土基因型；接种FR的发酵中，共分离到60个酿酒酵母单菌落，检测到11种（aa—kk）本土基因型；接种FX10的发酵中，共分离到60个酿酒酵母单菌落，检测到8种（a—h）本土基因型。

图2 BDX、XR、FR和FX10四种ADY工业生产中分离的酿酒酵母Interdelta指纹图谱

此外，选用9个微卫星位点进行微卫星分型，以商业酵母的SSR类型为对比，225个酿酒酵母单菌落共显示出16种本土基因型。接种BDX的发酵中检测到8种本土基因型（BDX-1—BDX-8）；接种XR和FX10的发酵中均检测到1种本土基因型，分别为XR-1和FX10-1；接种FR的发酵中检测到6种本土基因型（FR-1—FR-6）。利用PopGen软件统计其遗传多样性相关指数，9个微卫星位点共检测出75个等位基因，平均每个位点的等位基因数为8.3333个（表3）。C5位点上检测到11个等位基因，C4和C11位点上检测到10个等位基因，表现出较高的等位基因多样性；C8位点检测出5个等位基因，等位基因最少。在C11位点，最大等位基因和最小等位基因差值最大（144 bp）；在C8位点，最大等位基因和最小等位基因差值最小（22 bp）。根据Botstein等[22]提出的PIC判断标准：当PIC＜0.25时，该位点为低度多态；0.25＜PIC＜0.50时，为中度多态；当PIC＞0.50时，为高度多态。本研究中9个位点的PIC为0.6339—0.8620，平均值为0.7614，都为高度多态性位点（表3）。9个位点的观测杂合度（Ho）值为0.2000—0.5000，平均值为0.3519，期望杂合度（He）为0.6956—0.9032，平均值为0.8141，杂合度是衡量酿酒酵母群体遗传变异情况的一个参数，杂合度越高说明群体的遗传多样性越高[23]，从整体来看，本研究中分离的16株宁夏本土酿酒酵母在一定程度上处于中等遗传多样性水平。

表3 赤霞珠葡萄酒工业生产中分离的宁夏本土酿酒酵母菌株的遗传多样性水平

2.3 接种发酵中ADY定殖情况分析

根据Interdelta和SSR分型结果，分析接种商业ADY发酵中酿酒酵母不同基因型的数量变化，揭示其在发酵过程中的地位，发酵过程中3个时期的各基因型数量如图3所示。结果表明，商业ADY并没有在各个发酵阶段占据主导地位，对于不同的发酵阶段而言，优势酵母的基因型也存在差异。

接种BDX的发酵中，BDX存在于整个发酵过程中，基因型γ（SSR类型为BDX-6）、BDX、基因型β（SSR类型为BDX-7）分别是1、3和5 d的主导菌株。接种XR发酵中，Interdelta类型XR2、A、XR1分别是1、3和5 d的主导菌株，均对应SSR分析中的类型XR。Interdelta分析和SSR分析均显示FR不是相应发酵中的优势菌株，基因型bb（SSR类型为FR-2）和基因型ee（SSR类型为FR-4）是发酵中的主导菌株。接种FX10的发酵中，Interdelta类型基因型a、基因型b、FX10分别是1、3和5 d的主导菌株，均对应SSR分析中的类型fX10。

A：接种BDX的发酵；B：接种XR的发酵；C：接种FR的发酵；D：接种FX10的发酵

2.4 酿酒酵母菌株遗传多样性分析

根据菌株间的Jaccard相似系数构建4种ADY及16种本土基因型酿酒酵母菌株的聚类图，以说明20株酿酒酵母菌株间的亲缘关系（图4）。菌株之间的Jaccard相似系数越接近1，其亲缘关系越近。从聚类图可以看出，分离自相同发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异较大。

基因型FX10-1和商业酵母BDX聚在一个分支，基因型BDX-7和商业酵母FX10聚在一个分支，基因型FR-5和商业酵母XR聚在一个分支，基因型FR-6和商业酵母FR聚在一个分支，说明其亲缘关系较近。如图4所示，当Jaccard相似系数约为0.27时，分离自接种BDX发酵中的基因型BDX-1和BDX-3的菌株亲缘关系较远；当Jaccard相似系数约为0.29时，XR、FR-2、FR-4和FR-5被聚为一类，而分离自接种XR发酵中的2种基因型XR和XR-1表现出较远的亲缘关系；分离自接种FR发酵中的基因型FR和FR-6聚在一个分支，其亲缘关系较近；分离自接种FX10发酵中的基因型FX10、XR和FX10-1表现出较远的亲缘关系。

图4 商业酵母与本土酿酒酵母的UPGMA聚类图

3 讨论

本研究共分离出225个酿酒酵母单菌落，Intedelta指纹图谱将其分为42种基因型（其中36种本土基因型），而SSR分析结果显示出20个基因型（其中16种本土基因型），Interdelta菌株区分技术显示出了较高的区分能力。然而，贾佳等[24]的研究表明SSR的区分能力强于Interdelta。Intedelta指纹图谱法操作简单，成本较低，其结果为多条带图谱，容易出现暗带，给分析带来困难。SSR分析由于进行毛细管电泳，需合成荧光标记引物，成本较高，其结果是扩增片段大小的具体数值（bp），使不同实验室或课题组间的结果易于比较[25]。本研究中C12位点的观测杂合度最高，SCAAT3位点杂合率最低，而张留燕等[26]的研究中，SCAAT1和YPL009C两个位点杂合率高，YOR267C位点杂合率最低。因此，建议后续分析结合研究目的，选用合适的方法来得到满意的结果。

研究表明，即使在接种商业酵母的情况下，仍有本土酿酒酵母的不同株系共同参与发酵过程，本土酿酒酵母甚至可以表现出较强的竞争能力主导发酵过程[5,7,10,27]。由于不同酿酒酵母菌株的代谢产物存在差异，因而对葡萄酒质量的影响存在差异，这些本土酵母对葡萄酒质量的贡献程度有待研究。商业ADY在发酵中的定殖能力受菌株特性[1,27]、接种方式（复水活化或干粉直投）[8]和接种温度等[7]因素影响。本研究中，商业ADY在发酵各个阶段的定殖情况存在差异，由于本研究采用的原料基本理化指标及酿酒工艺基本一致，因此产生这种结果的主要原因可能与不同ADY的酿酒特性有关。商业ADY在葡萄酒发酵中的主导地位得不到保障，ADY对葡萄酒质量的贡献及影响需进一步研究。孙悦等[8]研究表明无论是浸渍前还是浸渍后接种，接种的ADY在各个发酵阶段均具有较高的定殖能力，目标菌株比例在90%以上。而Gil-Díaz等[1]研究发现，接种的ADY在整个发酵过程中的优势地位得不到保证，只有9个发酵中ADY的占比达到80%以上，而在16个发酵中接种的ADY占比低于50%。因此，对葡萄酒发酵过程中的酿酒酵母菌株多样性进行监控，挖掘潜在的功能微生物，利于建立微生物与葡萄酒品质间的联系，促进葡萄酒产品的地域特色和优质化生产。李梅花[27]的研究表明，对于接种不同酿酒酵母菌株的发酵而言，所分离到的酿酒酵母菌株多样性差异明显。本研究得到了类似结果，商业ADY并没有在所有发酵阶段占据主导地位，尤其是接种FR的发酵中，本土酿酒酵母始终占主导地位。本研究中，本土酿酒酵母（如Interdelta基因型中的β、基因型γ、基因型A、基因型a、基因型b、基因型bb和基因型ee）表现出较强的竞争力，这些优势本土酿酒酵母的发酵特性有待进一步研究，以便解释商业酵母干粉和本土酵母之间的竞争关系。为此，后续可重点研究如何调控商业菌和本土菌的竞争关系，来最大限度地提升葡萄酒品质。

通过选育本土优良酿酒酵母进行葡萄酒酿造，可避免葡萄酒的同质化问题，生产具有地域特色的葡萄酒[28-32]。本研究中，某些本土酵母在发酵中的定殖能力强于商业活性干酵母，这些优势本土酿酒酵母的工艺性状和香气分析有待进一步研究，以利用这些酵母菌生产凸显产区特色的葡萄酒。

4 结论

葡萄酒生产中使用的某些ADY由2种以上株系构成，且不同菌株在‘赤霞珠’葡萄酒发酵中的数量差异较大。接种商业ADY的葡萄酒发酵中，本土酿酒酵母基因型丰富，发酵是由本土酵母与商业酵母共同参与完成的，且二者在发酵过程中相互竞争，数量动态演替。

[1] GIL-DíAZ M, VALERO E, CABALLOS J M, GARCIA M, ARROYO T. The impact of active dry yeasts in commercial wineries from the denomination of origen “Vinos de Madrid”, Spain3 Biotech2019, 9(11): 382. doi: 10.1007/s13205-019-1913-3.

[2] BARRAJÓN N, ARÉVALO-VILLENA M, RODRÍGUEZ-ARAGÓN L J, BRIONES A. Ecological study of wine yeast in inoculated vats from La Mancha region. Food Control, 2009, 20(9): 778-783.

[3] CORDEROBUESO G, RODRÍGUEZ M E, GARRIDO C, CANTORAL JM. Rapid and not culture-dependent assay based on multiplex PCR-SSR analysis for monitoring inoculated yeast strains in industrial wine fermentations. Archives of Microbiology, 2017, 199(1): 135-143.

[4] DE CELIS M, RUIZ J, MARTÍN-SANTAMARÍA M, MARÍA, ALONSN A, MARQUINA D, NAVASCUÉS E, GOMEZ-FLECHOSO M A, BELDA I, SANTOS A. Diversity ofyeasts associated to spontaneous and inoculated fermenting grapes from Spanish vineyards. Letters in Applied Microbiology, 2019, 68(6). doi: 10.1111/lam.13155.

[5] VIGENTINI I, FABRIZIO V, FACCINCANI M, PICOZZI C, COMASIO A, FOSCHINO R. Dynamics ofpopulations in controlled and spontaneous fermentations for Franciacorta D.O.C.G. base wine production. Annals of Microbiology, 2014, 64: 639-651.

[6] LANGE J N, FAASSE E, TANTIKACHORNKIAT M, GUSTAFSSON F S, HALVORSEN L C, KLUFTINGER A, LEDDERHOF D, DURALL D M. Implantation and persistence of yeast inoculum in pinot noir fermentations at three Canadian wineries. International Journal of Food Microbiology, 2014, 180: 56-61.

[7] MATURANO Y P, LERENA M C, MESTRE M V, CASASSA L F, TORO M E, VAZQUEZ F, MERCADO L, COMBINA M. Inoculation strategies to improve persistence and implantation of commercialstrains in red wines produced with prefermentative cold soak. LWT-Food Science and Technology, 2018, 97: 648-655.

[8] 孙悦, 叶冬青, 褚越, 张怡飞, 刘延琳. 不同接种方式及温度对活性干酵母发酵的影响. 酿酒科技, 2019(3): 24-28, 37.

SUN Y, YE D Q, CHU Y, ZHANG Y F, LIU Y L. Effects of different inoculation methods & temperatures on fermentation of active dry yeast. Brewing Technology, 2019(3): 24-28, 37. (in Chinese)

[9] 何娟, 曹培鑫, 黄英子, 刘延琳. 贵人香冰酒大生产过程中酵母菌群结构及动态变化. 中国酿造, 2014, 33(5): 30-33.

HE J, CAO P X, HUANG Y Z, LIU Y L. Dynamics of wine related yeasts during industrial icewine fermentations of Italian Riesling. Brewed in China, 2014, 33(5): 30-33. (in Chinese)

[10] 宋育阳, 裴颖芳, 王国平, 刘延琳. 黑比诺葡萄接种发酵过程酵母菌的变化监控. 中国食品学报, 2010, 10(2): 125-130.

SONG Y Y, PEI Y F, WANG GP, Liu Y L. Monitoring of yeast changes during inoculated fermentation process of Pinot Noir grape. Chinese Journal of Food Science, 2010,10(2): 125-130. (in Chinese)

[11] 刘松涛, 李茜, 吕雯, 秦萍. 中国葡萄酒产业现状及发展趋势—以宁夏贺兰山东麓产区为例. 现代农业科技, 2019(9): 241-243.

LIU S T, LI Q, LÜ W, QIN P. Present situation and development trend of Chinese wine industry:A case study of producing area at Eastern Foot of Helan Mountain in Ningxia. Modern Agricultural Science and Technology, 2019(9): 241-243. (in Chinese)

[12] 孙悦. 不同氮素水平对酿酒酵母混合发酵特征的影响及其代谢物研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2016.

SUN Y. Effects of different nitrogen levels on the characteristics and metabolites ofduringmixedfermentation. [D]. Yangling: Northwest A & F University, 2016. (in Chinese)

[13] SUN Y, QIN Y, PEI Y F, WANG G P,JOSEPH C M, BISSON L, LINDA F, LIU Y L. Evaluation of Chinesewine strains from different geographical origins. American Journal of Enology and Viticulture, 2017, 68: 73-80.

[14] 孙悦, 张方方, 褚遂兴, 李佳幸, 邵帅, 张军翔. 接种不同嗜杀特性的酿酒酵母对赤霞珠发酵中酵母多样性的影响. 食品科学, 2020, 41(2): 166-172

SUN Y, ZHANG F F, CHU S X, LI J X, SHAO S, ZHANG J X. Effects ofstrains with different killer activity on the yeast diversity in inoculated fermentation of Cabernet Sauvignon. Food Science, 2020, 41(2): 166-172. (in Chinese)

[15] LEGRAS J L, RUH O, MERDINOGLU D, KARST F. Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization ofstrains. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102(1): 73-83.

[16] JUBANY S, TOMASCO I, DE LEO´N I P, MEDINA K, CARRAU F, ARRAMBIDE N, NAYA H, GAGGERO C. Toward a global database for the molecular typing ofstrains. FEMS Yeast Research, 2008, 8: 472-484.

[17] HALL B, DURALL D M, STANLEY G. Population dynamics ofduring spontaneous fermentation at a British Columbia Winery. American Journal of Enology and Viticulture,2011, 62(1): 66-72.

[18] STEFANINI I, ALBANESE D, SORDO M, LEGRAS J L, DE FILIPPO C, CAVALIERI D, DONATI C.IDentifier, SID: Strain-level analysis ofpopulations by using microsatellite meta-patterns. Scientific Reports, 2017, 7: 15343.

[19] 蒋文鸿, 严斌, 陶永胜. 昌黎赤霞珠葡萄相关酿酒酵母的分离与筛选. 食品工业科技, 2014, 35(12): 202-206, 209.

JIANG W H, YAN B, TAO Y S. Isolation and screening offrom grape harvested in Changli.Food Industry Technology, 2014, 35(12): 202-206, 209.(in Chinese)

[20] RICHARDS K D, GODDARD MATTHEW R, GARDNER RICHARD C. A database of microsatellite genotypes for. Antonie van Leeuwenhoek, 2009, 96(3): 355-359.

[21] TORIJA M J, ROZEÈS N, POBLET M, GUILLAMÓN J, MAS A. Yeast population dynamics in spontaneous fermentations: Comparison between two different wine-producing areas over a period of three years. Antonie van Leeuwenhoek, 2001, 79: 345-352.

[22] BOTSTEIN D, WHITE R L, SKOLNICK M, DAVIS R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 314-331

[23] 杨宽, 毛如志, 赵悦, 何迟, 王慧玲, 曹建宏, 速伟, 何霞红. 云南香格里拉葡萄酒产区酿酒相关酵母菌的生物多样性. 微生物学通报, 2018, 45(12): 2708-2721.

YANGK, MAO R Z, ZHAO Y, HEC, WANG H L, CAO J H, SU W, HE X H. Biodiversity of wine-related yeasts isolated from Shangri-La wine-producing region of Yunnan. Bulletin of Microbiology, 2018, 45(12): 2708-2721. (in Chinese)

[24] 贾佳, 王冠群, 朱丽霞, 韩培杰, 郭东起, 陈明. 新疆葡萄和葡萄酒相关酿酒酵母种群的结构特征. 大连工业大学学报, 2018, 37(2): 94-99.

JIA J, WANG G Q, ZHU L X, HAN P J, GUO D Q, CHEN M. Structure characteristics ofpopulation associated with grape and wine in Xinjiang. Journal of Dalian Polytechnic University, 2018, 37(2): 94-99. (in Chinese)

[25] 冯敏, 王春晓, 刘延琳. 利用微卫星多态性揭示酿酒酵母菌株遗传多样性. 中国农业科学, 2012, 45(12): 2537-2543.

FENG M, WANG C X, LIU Y L. Genetic diversity ofstrains revealed by Microsatellite sequence polymorphism.Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(12): 2537-2543. (in Chinese)

[26] 张留燕, 黄英子, 刘延琳. 利用微卫星标记分析酿酒酵母的遗传多样性. 食品科学, 2014, 35(1):130-133.

ZHANG L Y, HUANG Y Z, LIU Y L. Genetic diversity analysis ofstrains by Microsatellite marker technique. Food Science, 2014, 35(1): 130-133. (in Chinese)

[27] 李梅花. 复合酵母在赤霞珠发酵过程中酵母菌相互作用研究. 酿酒科技, 2016(11): 60-64.

LI M H. Interactions of yeast strains in the fermentation process of Cabernet Sauvignon. Brewing Technology, 2016(11): 60-64. (in Chinese)

[28] 苑伟. 优选酿酒酵母菌株酿酒特性的比较研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2010: 4-7.

YUAN W. Comparative study ofthevinification characteristic ofselectedwineyeast[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2010: 4-7. (in Chinese)

[29] 李双石, 李浡, 李文蕾, 吴志明, 苏宁. 天然酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用研究. 食品科技, 2012, 37(8): 87-91.

LI S S, LI S, LI W L, WU Z M, SU N. Application of indigenous yeast strain in the wine making. Food Science and Technology, 2012, 37(8): 87-91. (inChinese)

[30] ORTIZ M J, BARRAJÓN N, BAFFI M A, MARIA AV, BRIONES A. Spontaneous must fermentation: Identification and biotechnological properties of wine yeasts. LWT-Food Science and Technology, 2013, 50(2): 371-377.

[31] ŠURANSKÁ H, VRÁNOVÁ D, OMELKOVÁ J. Isolation, identification and characterization of regional indigenousstrains. Brazilian Journal of Microbiology, 2016, 47(1): 181-190.

[32] GAROFALO C, BERBEGAL C, GRIECO F, MARIA T, GIUSEPPE S, VITTORIO C. Selection of indigenous yeast strains for the production of sparkling wines from native Apulian grape varieties. International Journal of Food Microbiology, 2018, 285: 7-17.

Implantation and Persistence of Inoculated Active Dry Yeast in Industrial Wine Fermentations

1School of Food and Wine, Ningxia University, Yinchuan 750021;2College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi

【】The purpose of this study was explore the implantation and persistence of commercial active dry yeast (ADY) during industrial wine fermentations, and their competitive relationship between Chinese indigenousduring fermentation process, so as to provide the theoretical basis for the breeding of indigenousand provide the reference for the use of ADY in wine production.【】Industrial wine fermentations were carried out at wineries in Eastern Foot of Helan Mountain in Ningxia. Four vats of Cabernet Sauvignon gape must were inoculated with BDX, XR, FR and FX10, respectively. Samples were collected and analyzed at 1 d, 3 d and 5 d after the inoculation. Interdelta and SSR analysis were used to investigate the genotypes of differentstrains. Therefore, the number and proportion ofstrains in different fermentation stages were analyzed, and the colonization ability of commercial ADY was tracked. Genetic diversity parameters were calculated by PopGen32 software. The genetic correlation between commercial yeast and Ningxia indigenous yeast was revealed by NTsys2.10e software.【】Interdelta fingerprint showed 6 kinds of fingerprints, namely 6 genotypes. And XR and FR showed more than one genotype; BDX and FX10 showed one genotype, respectively. SSR analysis showed that there was one genotype in each ADY for the 9 locus. 225isolates were isolated from the 4 inoculated fermentations. Interdelta fingerprint showed 42 genotypes, of which 36 genotypes were indigenous strains. The degree of variability (16%, 42/225) was intermediate. SSR analysis showed 20 genotypes, of which 16 genotypes were indigenous strains. The analyzed 9 microsatellite prime pairs generated a total of 75 polymorphic bands, 8.3333 alleles for per locus. The heterozygosity observed was 0.2000-0.5000. The polymorphism information contents (PIC) of all strains at 9 loci were 0.6339-0.8620, suggesting that the 9 SSR loci were hypervariable. The indigenous genotypes were the most abundant in the fermentation inoculated with BDX (11 Interdelta types and 8 SSR types), followed by FR (11 Interdelta types and 6 SSR types). ADY did not dominate all three stages. Moreover, the genotypes of the dominant strains were also different for different stages in the same fermentation. Interdelta and SSR analysis showed FR was not dominant in the corresponding fermentation. Although BDX existed in the whole fermentation process, it was only dominant at d 3 after the inoculation. In the fermentation inoculated with XR and FX10, Interdelta analysis showed that they were not the dominant strains, while SSR analysis showed that they were the dominant strains in the corresponding fermentations, respectively. Indigenous strains of genotype β (SSR genotype BDX-7), genotype γ (SSR genotype BDX-6), genotype A (SSR genotype XR), genotype a (SSR genotype FX10), genotype b (SSR genotype FX10), genotype bb (SSR genotype FR-2) and genotype ee (SSR genotype FR-4) showed strong competitiveness in the corresponding fermentations. Cluster analysis showed that the genetic diversity among thestrains isolated from the same fermentation was large.【】The genotypes of indigenousstrains in the industrial wine fermentations were rich. The inoculated fermentations were completed by both indigenous strains and commercial ADY, and they competed with each other in the same fermentations and showed dynamic succession of different strains.

ADY; inoculated fermentation; strain typing; wine; SSR

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.016

2020-08-24；

2020-11-30

国家自然科学基金地区项目（31960473）、宁夏贺兰山东麓葡萄酒风格固化关键技术研究与示范（2020BCF01003）、宁夏大学引进人才科研项目、西夏区科技发展计划

孙悦，E-mail：yuesun86@126.com。通信作者张军翔，E-mail：zhangjunxiang@126.com

（责任编辑 赵伶俐）