两种国产海蛇排毒量的种间差异及形态相关性

刘其则,陈忠荫,吕金更,王 强,杜 宇,林炽贤

(海南热带海洋学院 a.水产与生命学院;b.海南省两栖爬行动物研究重点实验室,海南 三亚,572022)

0 引言

蛇毒是有毒蛇类毒腺分泌的混合物,是在长期的进化过程中产生用于捕食猎物的重要武器,使得蛇类的捕食模式由依靠机械力向利用化学力转变[1]。尽管毒液储量占毒蛇体质量极小的比例,但其生成过程往往需要代谢耗能以及一定的时间周期[2]818,[3]120,[4]32,[5]。因此,蛇毒又是有毒蛇类珍贵的化学武器,动物必须考虑优化使用[3]121。一般毒蛇的毒液储量可由排毒量指标(排毒量鲜质量、干质量和干物质含量)进行衡量,这3个指标往往受到毒蛇分类地位、地理分布、形态、年龄、性别、生理状态、毒牙间距、季节、温度、生境、食性和采毒频率等因素的影响[4]32,[6-7],[8]22。研究毒蛇的排毒量特征及影响因素,可间接衡量其潜在注入攻击对象体内的毒液量以及蛇伤危害程度,也可为蛇毒的开发利用提供参考[4]33。

中国地域辽阔,毒蛇资源丰富,其中海洋产毒蛇16种[9]。大多数海蛇性情温和,只有被激怒时才会攻击,与陆生毒蛇相比,海蛇伤人的发病率非常低[10]。人类在热带海洋捕捞时,海蛇常常会作为副产物随着渔获被捕捞上船,渔民在处理捕获物时就很容易被海蛇咬伤,因此超过一半的海蛇致伤病例与海洋捕捞作业有关[11]58,[12-13]。据统计,海蛇攻击人类的事件中,有20%的病患体内被明显注入毒液,并导致3%的死亡率[11]59。如果患者未得到有效治疗或紧急处理,死亡率甚至可高达50%[14]118。海蛇咬伤容易引发患者全身性症状,如瘫痪、视力模糊、呼吸衰竭和肌肉坏死等,这些临床表现主要是由其中的神经毒素和磷脂酶A2所造成的[11]60,[14]120。青环海蛇(Hydrophiscyanocinctus)和平颏海蛇(Hydrophiscurtus)作为国内分布较广、资源保有量相对较多的2种海蛇,其毒液的毒性大,致死性高,对海洋作业及海边旅游带来较大的危害。然而,国内有关这2种毒蛇的排毒量特征及其与形态、性别等相关性研究的工作匮乏。

本研究以青环海蛇和平颏海蛇为对象,测定其排毒量特征(鲜质量、干质量和干物质含量),并结合形态特征(头长、头宽、头体长、尾长和体质重),探讨排毒量特征的种间差异及其与形态特征之间的相关性,以期为2种海蛇所致蛇伤的临床治疗、抗蛇毒血清研制和蛇毒天然活性药物开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与蛇毒提取

实验用青环海蛇147条和平颏海蛇114条各采自中国南海海域,动物采集后饲养于海南省两栖爬行动物研究重点实验室循环海水驯养池,定期投饲冰冻或活体的鳗鲡目(Anguilliformes)鱼类,每天喷淋淡水15 min。取毒前动物至少禁食一周后,用套管法采集毒液[15],同一个体左右毒牙收集的毒液经合并后转入冻存管。新鲜蛇毒经冷冻干燥后存放至-80 ℃超低温冰箱。用数显游标卡尺和卷尺测量并记录动物头长(Head length,HL)lH、头宽(Head width,HW)wH、头体长(Snout-vent length,SVL)lSV和尾长(Tail length,TL)lT,用电子秤称量动物体质量(Body mass,BM)mB,并记录动物性别。称量并计算每条个体的排毒量鲜质量(Wet mass,WM)mW和干质量(Dry mass,DM)mD,用mD/mW×100 %作为干物质含量(Solid content,SC)cS。

1.2 数据分析

由于取毒失误、动物自咬或咬其他蛇等因素,导致部分样本的排毒量指标不准确,相应数据被剔除,最终70条青环海蛇和75条平颏海蛇的排毒量指标被用于统计分析。考虑到雌性个体在饲养过程中有怀孕现象,故不分析海蛇成体排毒量是否与BM有关。统计分析前,所有数据均进行正态性检验,用方差分析(ANOVA)、协方差分析(ANCOVA)和直线回归分析处理数据。用lH/lSV表示相对头长,用wH/lSV表示相对头宽,以此去除头体长对头部的影响,检测排毒量分别与头长及头宽之间的关系。描述性统计值使用平均值±标准误和最小值—最大值表示,显著性水平设为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 青环海蛇和平颏海蛇的形态特征

青环海蛇雌雄最大个体的SVL分别为148.8 cm和153.1 cm,平颏海蛇雌雄最大个体的SVL则分别为76.8 cm和 77.9 cm,青环海蛇的平均SVL(122.05 cm VS 69.25 cm)显著大于平颏海蛇(单因子ANOVA,F1,143=913.39,P<0.000 1),2种海蛇的平均SVL均无两性差异(allP>0.1)(表1)。2种海蛇SVL的频次分布均符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov test,allP>0.05)(图1)。以SVL为协变量,性别为因子的单因子ANCOVA检验发现,1)特定SVL为122 cm时,雄性青环海蛇的矫正平均TL(10.29 cm VS 9.61cm)显著大于雌性(P<0.05),而HL和HW均无两性差异(allP>0.1)(表2)。特定SVL为69 cm时,雌性平颏海蛇的矫正平均HW(2.06 cm VS 1.73 cm)显著大于雄性(P<0.000 1),而TL和HL均无两性差异(allP>0.1)(表1)。以SVL为协变量,物种为因子的单因子ANCOVA检验发现,2种海蛇的TL(F1,142=10.88,P<0.01)、HL(F1,142=314.12,P<0.001)和HW(F1,142=117.51,P<0.001)存在显著的种间差异;特定SVL为95 cm时,平颏海蛇的矫正平均TL(9.62 cm VS 8.27 cm)、HL(3.99 cm VS 2.46 cm)和HW(2.34 cm VS 1.08 cm)均显著大于青环海蛇。

H.cyanocinctus:青环海蛇;H.curtus:平颏海蛇;Females:雌性;Males:雄性。图1 青环海蛇和平颏海蛇头体长频次分布

表1 青环海蛇和平颏海蛇形态特征及排毒量的描述性统计值及统计分析

注:描述性统计值用平均值±标准误和最小值～最大值表示,显著性水平设为α= 0.05。头体长、鲜质量、干质量及干物质含量的两性间比较:用单因子ANOVA分析。体质量、尾长、头长及头宽的两性间比较:以头体长为协变量,用单因子ANCOVA分析。

2.2 海蛇排毒量与其形态特征的相关性

青环海蛇雌性和雄性排毒量的鲜质量、干质量和干物质含量分别为43.18 mg和33.36 mg、9.14 mg和8.05 mg、21.51 %和25.01%,平颏海蛇雌性和雄性排毒量的鲜质量、干质量和干物质含量分别为33.16 mg和34.71 mg、4.40 mg和5.30 mg、13.30 %和15.05%;单因子 ANOVA检验发现,2种海蛇排毒量的鲜质量、干质量和干物质含量均无两性差异(allP>0.05)(表1)。

线性回归分析发现,青环海蛇排毒量的鲜质量(mW=-23.24+0.53lSV,R2=0.15,F1,68=11.50,P<0.01;mW=-18.13+19.37lH,R2=0.13,F1,68=10.40,P<0.01;mW=16.38+16.77wH,R2=0.07,F1,68=4.79,P= 0.03)分别与SVL、HL和HW之间呈显著的正相关;干质量(mD=-2.28+0.09lSV,R2=0.08,F1,68=5.51,P= 0.02;mD=-1.62+3.44lH,R2=0.07,F1,68=5.27,P<0.05)分别与SVL和HL之间呈显著的正相关,而干质量(mD=7.97+0.64wH,R2=0.002,F1,68=0.11,P= 0.74)与HW无关;干物质含量(cS=34.63-0.10lSV,R2=0.06,F1,68=4.03,P= 0.05;cS=32.66-3.41lH,R2=0.04,F1,68=3.05,P= 0.09)分别与SVL 和HL无关,而干物质含量(cS=34.69-8.43wH,R2=0.17,F1,68=14.29,P<0.001)与和HW之间呈显著的负相关。考虑到头体长与头部形态之间的相关性,我们去除了头体长的影响,线性回归分析相对头长和相对头宽与排毒量指标之间的相关性,结果显示青环海蛇排毒量的鲜质量(mW=49.85-343.04lH,R2=0.001,F1,68=0.07,P= 0.79;mW=32.06+758.29wH,R2=0.004,F1,68=0.30,P= 0.58)和干质量(mD=9.86-37.10lH,R2=0.0002,F1,68=0.01,P= 0.90;mD=13.95-415.96wH,R2=0.02,F1,68=1.59,P= 0.21)与头长和头宽无关,干物质含量(cS=17.72-178.23lH,R2=0.003,F1,68=0.20,P= 0.65)与头长无关,但仍与头宽呈负相关(cS=39.49-1430.34wH,R2=0.16,F1,68=13.35,P<0.001)。

线性回归分析发现,平颏海蛇排毒量的鲜质量(mW=-62.31+1.39lSV,R2=0.11,F1,73=8.54,P<0.01;mW=-60.62+27.56lH,R2=0.10,F1,73=7.64,P<0.01)分别与SVL和HL之间呈显著的正相关,而鲜质量(mW=44.95-5.76wH,R2=0.01,F1,73=0.62,P= 0.44)与HW无关;干质量(mD=-13.35+0.26lSV,R2=0.14,F1,73=11.42,P<0.01;mD=-12.77+5.10lH,R2=0.12,F1,73=9.85,P<0.01)分别与SVL和HL之间呈显著的正相关,而干质量(mD=10.18-2.80wH,R2=0.07,F1,73=5.70,P= 0.02)与HW之间显著的负相关;干物质含量(cS=1.14+0.18lSV,R2=0.03,F1,73=1.84,P= 0.18;cS=1.16+3.71lH,R2=0.02,F1,73=1.72,P= 0.19)分别与SVL和HL无关,而干物质含量(cS=25.53-5.95wH,R2=0.12,F1,73=9.87,P<0.01)与HW之间显著的负相关.考虑到头体长与头部形态之间的相关性,去除了头体长的影响。线性回归分析相对头长和相对头宽与排毒量指标之间的相关性,结果显示，平颏海蛇排毒量的鲜质量(mW=45.72-243.68lH,R2=0.0009,F1,73=0.06,P= 0.80;mW=59.72-918.27wH,R2=0.05,F1,73=3.60,P= 0.06)与头长和头宽无关,干质量(mD=7.55-57.88lH,R2=0.002,F1,73=0.13,P= 0.72)和干物质含量(cS=15.61-35.35lH,R2=0.0003,F1,73=0.02,P= 0.89)与头长无关,但仍与头宽呈负相关(mD=12.78-285.11wH,R2=0.17,F1,73=14.52,P<0.001;cS=27.07-465.48wH,R2=0.16,F1,73=14.05,P<0.001)。

2.3 海蛇排毒量的种间比较

单因子 ANOVA检验发现,2种海蛇排毒量的鲜质量(F1,143=5.52,P<0.05)、干质量(F1,143=39.98,P<0.000 1)和干物质含量(F1,143=78.56,P<0.000 1)存在显著的种间差异,青环海蛇排毒量的平均鲜质量(41.21 mg VS 33.66 mg)、干质量(8.92 mg VS 4.69 mg)和干物质含量(22.21 % VS 13.86 %)均显著大于平颏海蛇。

3 讨论

一般常采用咬膜皿法和套管法对毒蛇进行无损伤采集毒液,可依据毒腺毒量的物种属性选用相应的采集方法[4]34,[15]。由于海蛇毒量较少,本研究采用了套管法并用手按摩毒腺的方式获取青环海蛇和平颏海蛇毒液,可以减少蛇体口腔分泌物对蛇毒的污染,并最大限度降低了蛇毒的损耗。采毒频率提高或短时间内持续排毒显著影响毒蛇的毒液产量。如对国产8种陆生毒蛇排毒量研究中发现,取毒周期越短,毒量越少[16]。检测短尾蝮在短时间内5次连续自主咬物的排毒量发现,其首次咬物释放毒液的干质量占排毒量总干质量的57.7%,随着排毒序次的递增,毒量逐渐降低[17]。毒蛇在排毒后至毒腺中毒液再次充满需要一定的时间[2]819,因此取毒不能过于频繁,一般考虑至少间隔20 d,以免影响蛇毒品质及造成蛇体负担。此外,采毒前应至少禁食7 d以上,以防进食释放毒液影响排毒量的准确性。2种海蛇的获取与采集时间也充分考虑了上述因素。

某些毒蛇的形态呈现显著的两性差异,其毒液产量也呈现相关联的变化。如棕树蛇(Pseudonajatextilis)雄性体长明显较雌性长,舟山眼镜蛇雄性头长、头宽大于雌性,雄性的排毒量要明显高于雌性;美洲矛头蝮(Bothropsjararaca)刚好相反,3年龄雌性体长为雄性的1.5倍,其泌毒量为雄性的近10倍

[4]32,[18]1581,[19]。这应与两性在生存过程中能量需求差异有关,任何一种性别维持较大体型或雌性需要进行繁殖都需要额外的能量投入,因此,强化排毒量有助于其捕获较多、较大的猎物。本研究中,因2种海蛇部分雌性个体处于怀卵状态,体质量的两性差异不足以解释二者对排毒量的影响,且尾长对排毒量亦不存在直接贡献,故不探讨这2个形态指标与排毒量之间的关系。除平颏海蛇的头宽存在性别差异外,2种海蛇其余形态特征均无性别差异,可能预示了两性个体的排毒量差异将不会太大,统计结果也验证了排毒量鲜质量、干质量和干物质含量不存在性别差异。

不少研究认为毒蛇的排毒量与形态特征(个体大小、体质量、头长和头宽)显著相关。如阿根廷的美丽矛头蝮(Bothropsalternatus)和北方黑尾响尾蛇(Crotalusdurissusterrificus)的排毒量干质量随着体长的增加而增加[8]23。国产舟山眼镜蛇(Najaatra)的排毒量干质量随着头体长、体质量、头长和头宽的增加而增加,去除头体长的影响,排毒量干质量不受相对体质量、相对头宽的影响,但仍与相对头长呈显著正相关[4]40。由于取样较少或样本间形态特征的变异度较小,有可能导致这种相关性不是很显著[18]1582。尽管本研究所检测2种海蛇的排毒量鲜质量、干质量与头宽的相关性不是很一致,但与头体长和头长存在显著的正相关,验证了毒蛇排毒量受主要形态特征的影响;去除头体长影响后,头部大小(相对头长、头宽)与排毒量不存在相关性或相关性降低,表明头部大小与排毒量之间的相关性是头体长影响头部形态的间接结果。体型较大毒蛇维持自身的能量需求相对较大,可能捕食较大、较多的猎物,因而需要释放较多的毒液以征服猎物[4]32,[18]1581。本研究中,青环海蛇的排毒量鲜质量和干质量均大于平颏海蛇,加之其头体长和体质量均比平颏海蛇约大一倍,推测青环海蛇可能比平颏海蛇捕食较大、较多的猎物。干物质含量越高,意味着毒液越黏稠,其在猎物体内的扩散速度也越慢,青环海蛇毒的干物质含量要高于平颏海蛇,意味着其要快速征服猎物,需有较高的毒量或毒性。

总体而言,2种海蛇排毒量鲜质量、干质量与头体长、头长均存在显著的正相关;青环海蛇排毒量鲜质量与头宽呈正相关,但与干质量无关;平颏海蛇排毒量鲜质量与头宽无关,但与干质量呈负相关;干物质含量与头体长、头长无关,与头宽呈负相关。2种海蛇的3个排毒量指标均不存在性别差异。2种海蛇排毒量鲜质量、干质量和干物质含量存在显著的种间差异。排毒量差异的探讨可为抗海蛇毒血清制备所需蛇毒原料采集和海蛇咬伤诊疗提供一定的参考。