糖皮质激素对晶状体上皮细胞生物学功能调控作用的生物信息学分析

闫楚凡 韩笑 张劲松

中国医科大学附属第四医院眼科，沈阳 110059

糖皮质激素性白内障多见于全身或局部长期使用糖皮质激素者，其发病机制尚未完全阐明。许多生物学过程被证明与糖皮质激素性白内障的发生相关，如细胞分化异常和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)的激活等[1-3]；糖皮质激素还导致晶状体中E钙黏附蛋白和N钙黏附蛋白的表达量下降，而细胞黏附在晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)的正常分化和迁移中有重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为18～22个核苷酸的非编码RNA，与基因的3’端非翻译区结合，通过抑制基因的转录来影响蛋白的表达。既往研究发现，miR-29a可以靶向抑制GR mRNA的表达，同时其本身的表达量又依赖于GR的激活，形成一个负反馈回路，这个特点在糖皮质激素治疗过程中有助于减缓GR水平的逐渐降低[5]，这为糖皮质激素性白内障的治疗提供了新的思路。目前关于miRNA与糖皮质激素性白内障的研究尚未见报道。本研究基于生物信息学方法分析经地塞米松处理的LECs中差异基因的表达及其相关的生物学功能，筛选并验证hub基因的表达，预测与其最有可能相关的miRNA，以期为白内障的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 人LECs细胞株HLE-B3细胞购自美国ATCC公司。

1.1.2主要试剂及仪器 地塞米松、Trixon X-100(北京索莱宝科技有限公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Sigma公司)；MEM培养液、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(江苏凯基生物技术股份有限公司)；胎牛血清(澳洲AusGeneX公司)；青链霉素混合液(美国HyClone公司)；RNA iso Plus、实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；质量分数4%多聚甲醛(武汉博士德生物工程有限公司)；甘氨酸(大连美仑生物技术有限公司)；mRNA引物(武汉金开瑞生物工程有限公司)；EdU细胞增生检测试剂盒(广州锐博科技有限公司)。PCR逆转录仪(美国Bio-Rad公司)；实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystem公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 不同生物信息学方法对地塞米松处理的HLE-B3细胞生物学功能的评估

1.2.1GEO2R法分析HLE-B3细胞差异基因 从公开数据库GEO中下载GSE3040数据集，该数据集由Gupta等[6]上传。该数据集中，用DMSO处理的HLE-B3细胞设置为对照组，经过1 μmol/L地塞米松处理16 h的HLE-B3细胞设置为实验组，每组3个样本。通过Affymetrix Human Genome U133A Array平台，得到不同样本间基因表达数据。参照文献[7]的方法，利用GEO数据库的生信分析工具GEO2R，以倍数变化>2、P值<0.05为条件筛选分析2个组间差异基因的表达。利用graphGP网站(https://www.ehbio.com/ImageGP/)，以logFC为横坐标、-log10(Pvalue)为纵坐标绘制该数据集差异基因的火山图。蓝色代表下调基因，紫色代表上调基因，黄色代表表达无差异的基因。

1.2.2利用Metascape网站进行差异基因功能富集分析 打开Metascape网站(http://metascape.org/gp/index.html/)[8]，将之前得到的差异基因名称或者基因ID输入基因列表并提交，即可获取功能富集柱图。所有富集到的词条来源于GO生物学过程、KEGG通路、Reactome基因集、Canonical通路及CORUM。收集P值<0.01、最小计数为3、富集因子>1.5的项，并根据成员的相似性进行分组。在对丰富项进行层次聚类时，采用Kappa分数作为一致性度量，一致性>0.3的子树作为1个聚类，选择集群中最具统计意义的术语来表示集群。

1.2.3作图法分析hub基因 利用STRING数据库(v10.5,https://string-db.org/cgi/input.pl)获得差异基因相互关系数据，将其导入cytoscape软件[9]，分析并制作蛋白互作网络图，在cytoscape中安装cytohubba app，选择MCC方法分析前25位hub基因及其相互关系，颜色越深表示基因重要性越高。

1.2.4mirCode预测与hub基因相关的miRNA 在mirCode数据库(http://www.mircode.org)[10]中下载已知的高度保守的miRNA数据集，筛选出可能与前10个hub基因有调控关系的miRNA，利用cytoscape软件，制作出预测的hub基因与miRNA的调控网状图。蓝色六边形点代表筛选出的关键hub基因，紫色圆点是与其相关的miRNA。

1.3 地塞米松处理后HLE-B3细胞生物学功能变化的离体细胞实验

1.3.1细胞培养及分组 将冻存的HLE-B3细胞从-80 ℃冰箱中取出，迅速将冻存管放到37 ℃水浴锅中轻轻摇晃解冻1～2 min，置于低速离心机中，离心半径16 cm，1 000 r/min离心3 min，弃上清液。用1 ml完全培养基重悬细胞并将其均匀接种于直径6 cm培养皿中，添加3 ml完全培养基。置于37 ℃、体积分数5% CO2温箱中培养，待细胞融合至80%～90%时用胰蛋白酶消化并1∶ 3传代。取处于对数生长期的细胞(第3代及以后的细胞)，分别加入1 μmol/L DMSO和1 μmol/L地塞米松，置于37 ℃、5% CO2温箱中培养16 h，作为对照组和实验组，进行后续实验。

1.3.2EdU实验检测HLE-B3细胞增生情况 取处于对数生长期的HLE-B3细胞接种至96孔板中，分别设置实验组和对照组，每组3个复孔。用完全培养基按1 000∶ 1稀释EdU溶液，终浓度为50 μmol/L，每孔加入100 μl该培养基，温箱孵育2 h，弃培养液，PBS清洗2次，每次5 min。每孔加入4%多聚甲醛50 μl室温下固定30 min，弃固定液，每孔加入质量浓度2 mg/ml甘氨酸50 μl，脱色摇床孵育5 min后弃液，每孔加入100 μl PBS，脱色摇床清洗5 min后弃液。每孔加入100 μl体积分数0.5% TrixonX-100脱色摇床孵育10 min，PBS清洗1次，5 min。每孔加入100 μl Apollo染色反应液，避光室温摇床孵育30 min后弃液(之后步骤均避光进行)，每孔加入0.5% Trixon X-100各100 μl，摇床清洗2次，每次10 min。每孔加入100倍稀释Hoechst33342各50 μl，室温下孵育5 min复染核，PBS清洗3次，每次5 min。荧光显微镜下观察染色情况，绿色荧光染色细胞为增生期细胞，蓝色荧光染色细胞为活细胞。细胞增生率=增生期细胞数/活细胞数×100%。

1.3.3实时荧光定量PCR检测hub基因相对表达量 采用Trizol法分别提取实验组和对照组HLE-B3细胞的RNA，分光光度计测定RNA的浓度和纯度，将其逆转录成cDNA，前10个hub基因的引物序列见表1。采用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR实验，按照试剂盒说明书步骤进行实验。实验条件：96 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40个循环，添加熔解曲线。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

表1 糖皮质激素处理HLE-B3细胞中排名前10位hub基因的引物序列Table 1 The primer sequence of top 10 hub genes in glucocorticoid treated HLE-B3 cells引物名称序列(5’-3’)SST正向:CTCCCTCGGACCCCAGACTC反向:AGGGCATCATTCTCCGTCTGGCXCL8正向:AGCTCTGTGTGAAGGTGCAGT反向:TGGGGTGGAAAGGTTTGGAGTGRM1正向:CCTCTGATGTTGTCCGCATGC反向:CCCCTGCCTTCTTTCTTCGGAGNRH1正向:TCTACTGACTTGGTGCGTGGA反向:CGTTGGGTTTCTGCCAGTTGACXCL5正向:GCTGCGTTGCGTTTGTTTACA反向:CGTTCTTCAGGGAGGCTACCAGRK5正向:GACCCTCCCTTCGTTCCAGAC反向:ATTGACGCCCTTCACAGTGGAPPBP正向:GGAAGTGATCGGGAAAGGAAC反向:ATCTGGGTCCAGGCAGATTTTCX3CR1正向:ACAGCAAGAAGCCCAAGAGTG反向:AGGGCAAAGTGGCTACAAACAPYY正向:AGGAGCTGAACCGCTACTACG反向:GGGGAAGAACGTTTTGGAAAGEDNRA正向:GATCACCGTCCTCAACCTCTG反向:AAAGGAATCCCAATTCCCTGA

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0和Graphpad Prism 5软件进行统计分析及作图。计量资料的数据经K-S检验证实呈正态分布，以mean±SD表示；实验组和对照组中的SST、CXCL8、GRM1、GNRH1、CXCL5、PPBP、CX3CR1、PYY、EDNRA、GRK5的mRNA相对表达量差异比较，以及HLE-B3细胞增生值差异比较均采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地塞米松作用后LECs中差异基因的筛选

通过GEO2R分析数据，得到341个差异基因，其中上调基因为300个，下调基因为41个。下调基因中差异最显著的5个基因是SLC12A1、MED13L、ALDH5A1、SLC15A3和WWC1基因；上调基因中差异最显著的5个基因是SCNN1A、ANKRD36、FKBP5、PYY和ADH1B基因(图1)。

图1 HLE-B3细胞差异基因表达火山图 蓝色代表在糖皮质激素性白内障中表达下调的基因，紫色代表糖皮质激素性白内障中表达上调的基因，黄色代表表达无差异的基因Figure 1 Volcano plot of differentially expressed genes in HLE-B3 cell Blue spots represented the down-regulated genes and purple spots represented the up-regulated genes,and yellow spots represented the genes without statistic difference in expression level in glucocorticoid induced cataract

2.2 地塞米松作用后2个组HLE-B3细胞增生值比较

HLE-B3细胞差异基因生物学功能富集分析列出了341个差异表达基因富集量最多的前20个词条，结果显示富集量最大的是对HLE-B3细胞增生的负向调节[-log10(P)=5.73]，第2和第3分别是细胞对脂多糖的反应[-log10(P)=5.14]和细胞外基质的降解[-log10(P)=5.12](图2)。EdU细胞增生实验结果显示，实验组细胞增生率为(8.09±0.20)%，明显低于对照组的(39.63±0.80)%，差异有统计学意义(t=38.43，P<0.01)(图3)。

图2 HLE-B3细胞差异基因生物学功能富集分析 列出341个差异基因富集到的前20个词条Figure 2 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes in HLE-B3 cell The top 20 terms in functional enrichment analysis among 341 differentially expressed genes

图3 EdU细胞增生实验检测地塞米松对HLE-B3细胞增生的调控作用 A：实验组和对照组细胞染色(标尺=100 μm) 蓝色代表细胞核，绿色代表增生期细胞 B：实验组与对照组LECs增生率比较 与对照组比较，aP<0.01(独立样本t检验，n=3)Figure 3 The effect of dexamethasone on HLE-B3 cell proliferation tested by EdU proliferation assay A:Staining results of the experimental group and control group(bar=100 μm) Blue spots represented cell nuclei,and green spots represented cells in proliferation B:Comparison of LECs proliferation rate between the two groups Compared with the control group,aP<0.01(Independent-samples t test,n=3)

2.3 地塞米松作用后2个组HLE-B3细胞中hub基因mRNA相对表达量比较

排名前10位的hub基因分别为SST、CXCL8、GRM1、GNRH1、CXCL5、PPBP、CX3CR1、PYY、EDNRA和GRK5基因，其中唯一下调的是GRK5基因，其余表达均上调(图4)。实时荧光定量PCR结果显示，在得到的10个hub基因中，实验组HLE-B3细胞中SST、CXCL8、GRM1、PYY和EDNRA mRNA相对表达量较对照组明显升高，CXCL5和GRK5 mRNA的相对表达量较对照组明显降低，2个组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；2个组GNRH1、PPBP和CX3CR1 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

图4 hub基因及蛋白互作网络图 A：糖皮质激素处理HLE-B3细胞中的hub基因 基因的颜色由红变黄，代表重要性逐渐降低 B：差异基因的蛋白互作网络图 紫色的点代表在糖皮质激素处理HLE-B3细胞中表达上调的基因，蓝色的点代表表达下调的基因 图5 与hub基因相关的miRNAs 蓝色六边形点代表筛选出的hub基因，紫色圆点代表与其相关的miRNAFigure 4 Hub genes and protein-protein interaction network A:Hub genes in glucocorticoid treated HLE-B3 cells The spots color changed from red to yellow,which meant the importance of genes gradually decreased B:Protein-protein interaction network of differentially expressed genes Purple spots represented the up-regulated genes and blue spots represented the down-regulated genes in the glucocorticoid-treated HLE-B3 cells Figure 5 The miRNAs associated with hub genes The blue hexagons represented hub genes,and purple spots represented miRNAs related to them

表2 2个组HLE-B3细胞中前10位hub基因mRNA相对表达量比较(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative mRNA expression levels of top 10 hub genes in HLE-B3 cells between the two groups (mean±SD)组别样本量不同基因mRNA相对表达量SSTCXCL8GRM1GNRH1CXCL5GRK5PPBPCX3CR1PYYEDNRA对照组31.02±0.131.00±0.061.00±0.061.03±0.161.00±0.061.02±0.151.06±0.251.00±0.011.36±0.081.05±0.21实验组32.09±0.121.53±0.112.08±0.350.60±0.030.47±0.120.26±0.020.80±0.020.97±0.044.35±0.097.17±1.56t值5.9924.1683.0412.5694.0515.1141.0260.79225.1903.882P值0.0040.0140.0380.0600.0150.0070.3630.473<0.010.017 注:独立样本t检验 Note:Independent-samples t test

2.4 HLE-B3细胞中与hub基因相关的miRNA预测

mirCode预测结果显示，与hub基因关联最密切的前6位miRNA分别是miR-15abc、miR-214、miR-23abc、miR-129-5p、miR-132和miR-24(图5)。

3 讨论

随着糖皮质激素越来越广泛地应用于临床，糖皮质激素性白内障患病人数也逐渐增多，早在1960年就有研究者发现在长期使用糖皮质激素治疗风湿性关节炎的患者中，有39%在治疗过程中出现后囊下白内障[11]。单一的基因表达差异不足以解释疾病形成的原因。本研究通过高通量测序获得基于糖皮质激素作用于人HLE-B3细胞的差异基因，从而模拟糖皮质激素性白内障的发病过程中基因表达的数据。利用现有的生物分析工具，分析出大量有表达差异的基因及其之间的相互作用关系，以及具体影响了哪些生物学功能。

既往研究多认为，糖皮质激素通过促进LECs向间质细胞的转化，从而导致后囊下白内障的形成，且其发生率随着糖皮质激素剂量的增加而升高[12]。本研究通过差异基因的功能富集分析发现，1 μmol/L地塞米松很可能会抑制HLE-B3细胞的增生，并通过EdU实验证实了这一点。之前有研究表明低浓度(100 nmol/L)的地塞米松可以促进LECs的增生[3]，由此可以推测随着地塞米松浓度的增加，其逆转了对细胞增生的调控作用。晶状体由LECs和其分化而来的纤维细胞构成，后囊下白内障主要由LECs过度增生及上皮-间质转化异常造成。既往研究发现地塞米松能够抑制鼠晶状体上皮外植体中LECs的上皮-间质转化[13]，本研究发现地塞米松能够抑制LECs增生，因此其有可能应用于白内障的治疗。

已有研究发现，SST基因在糖尿病视网膜病变和黄斑水肿患者玻璃体中表达减低[14-15]；CXCL8基因在糖尿病视网膜病变患者房水中的表达水平远高于无视网膜病变糖尿病患者，它能介导白细胞的激活与血管内皮细胞的黏附[16]；CXCL5基因在干眼患者泪液中的表达量升高[17]；GRK5基因可以促进视紫红质磷酸化，导致夜盲[18]；PPBP基因的表达量在视网膜中央静脉阻塞患者玻璃体中显著升高[19]；CX3CR1基因可以调控小胶质细胞介导的光感受器的退化，是视网膜色素变性的潜在治疗靶点[20-21]；阻断EDNRA基因可以抑制病理性新生血管生成，并提高早产儿视网膜病变患者的视力[22]；但GRM1、GNRH、PYY和F2RL3尚未见在眼科学领域的研究报道。本研究中排名前10位的hub基因在白内障以及糖皮质激素性白内障中均无具体研究，它们能否延缓疾病的发生或治疗糖皮质激素性白内障还有待进一步探讨；同时，糖皮质激素性白内障的hub基因多与视网膜疾病相关，2种疾病之间是否有相互关系，目前仍不清楚。

许多研究发现，miRNA在疾病的发生和发展中十分重要，目前一些miRNA相关药物已进入临床前试验和临床试验阶段，如miR-34模拟物用于治疗血液系统恶性肿瘤已进入I期临床试验阶段，它还可以抑制肺癌、肝癌的生长[23]。在小鼠非小细胞肺癌模型中发现，miR-200模拟物可以增强辐射敏感度并延长小鼠的生存时间[24]，提示miRNA可以作为治疗疾病的新靶点。本研究预测出与hub基因相关的miRNA目前均未在激素性白内障中有具体研究，但在高糖诱导的LECs上皮-间质转化模型中，miR-214的表达量显著下降，山奈酚和lncRNA PVT1都可以通过靶向调节miR-214来调控LECs的增生和上皮-间质转化[25-26]；经过正常晶状体与白内障晶状体测序对比后发现，miR-23在透明晶状体中的表达水平高于白内障晶状体[27]；过表达miR-24直接作用于p53基因，促进LECs凋亡[28]。

综上所述，本研究筛选了糖皮质激素性白内障模型中的差异基因并进行了功能富集分析，发现1 μmol/L地塞米松能够显著抑制HLE-B3细胞增生，通过实验验证前10位hub基因中有6个与分析结果相符，同时预测了与糖皮质激素性白内障最有可能相关的6个miRNA，可以作为下一步研究糖皮质激素性白内障的具体指标。需要说明的是，本研究为离体细胞学研究，并非来自在体模型，如动物模型和人体标本研究，研究结果是否与在体研究一致尚不清楚，仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突