通过抑制水稻miR168改良产量、抗性和生育期

李 燕，王 贺，朱 勇，张凌荔，鲁均华，王文明

（四川农业大学西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室，成都 611130）

水稻是全球最重要的粮食作物之一。产量、生育期和抗性是水稻生产中的3个关键因素。然而，抗性与产量之间往往存在拮抗作用，免疫激活和抗病性的提高，常常以牺牲产量为代价，成为抗病种质创新的一个瓶颈问题[1-2]。同时，产量和生育期之间也存在平衡关系，高产的种质资源往往具有较长的全生育期[3-4]，不利于农业生产的高效节能。目前，还没有单一基因可同时增产、增抗并缩短生育期的相关报道。寻找能同时协调上述三要素的基因，可为水稻高产抗病研究提供新的理论基础和备选基因资源。

MicroRNA（miRNA）是生物体内源的长度约为19～24个碱基的单链 RNA，与 Argonaute（AGO）蛋白结合，形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），结合到与miRNA反向互补的DNA或RNA上，通过介导DNA甲基化修饰，RNA切割，以及阻断mRNA翻译等，调控基因表达。miRNA全方位控制植物的生长，发育和免疫[5-6]。我们在前期研究中发现，Osa-miR168（miR168）受稻瘟菌侵染诱导，而miR168的靶标基因编码了RISC的关键组成蛋白AGO1（AGO1a，AGO1b，AGO1c，AGO1d）。但是，miR168 如何通过AGO1调节稻瘟病抗性，以及如何影响水稻生长发育尚不清楚。

为了进一步研究miR168在稻瘟病抗性中的作用，我们构建了过表达miR168的转基因材料OX168，以及抑制miR168功能的转基因材料 MIM168。OX168材料中miR168累积显著增加，AGO1表达水平显著降低；反之，MIM168材料中miR168累积减少，AGO1表达增加。农艺性状分析显示，与对照相比，OX168株高增加，有效分蘖显著减少，千粒重有所增加；相反，MIM168株高降低，有效分蘖显著增加，千粒重有所降低。另外，OX168的营养生长期延长，花期延迟，籽粒晚熟；而MIM168营养生长期缩短，花期提前，籽粒早熟。这些结果说明，改变miR168在水稻中的累积，可以影响水稻的农艺性状和生育期，并可能影响产量。进一步连续3年的大田产量分析结果显示，在水稻正常生长季节，与对照相比，MIM168增产30%～40%，但OX168减产20%～40%。这一结果证明，抑制miR168的功能，可以有效提高水稻产量。

我们的前期研究结果显示，miR168响应稻瘟菌侵染[7]。病圃抗性压力实验结果显示，与正常大田种植材料相比，对照材料减产约13%，MIM168材料减产仅4%左右，与对照相比增产最高达75%，而OX168则减产 20%～40%，说明抑制miR168的功能，可以提高稻瘟病抗性和保障增产。我们进一步在实验室内分析了转基因材料对3个不同来源的稻瘟菌株（国际通用菌株，中国北方和南方大田分离菌株）的抗性反应。与大田实验结果一致，与对照相比，MIM168对这3个菌株的抗病性均增强，侵染部位的病斑面积减小，菌量减少，而OX168则呈现相反的表型。另外，OX168材料上稻瘟菌的侵染进程显著加快，侵染部位H2O2累积减少，H2O2合成相关基因和抗性相关基因的表达水平也显著降低；相反，MIM168材料中稻瘟菌的侵染进程显著延迟，H2O2累积增加，相关基因的诱导水平也显著提高。这些结果证明，miR168削弱稻瘟病抗性，而抑制miR168的功能可以增强稻瘟病抗性。

为了明确miR168是否通过AGO1来调控水稻生长发育和抗性，我们构建了沉默AGO1的转基因材料（AGO1i），AGO1的表达在转基因材料中被显著抑制。与OX168材料的表型一致，AGO1i株高增加，籽粒变大，有效分蘖减少，产量显著降低；同时，AGO1i对稻瘟菌的感病性也显著增加，稻瘟菌的侵染进程加快，侵染部位H2O2的累积也显著减少，暗示miR168通过AGO1调控水稻生长和抗性。

我们接下来分析miR168-AGO1模块通过哪些下游信号通路调控水稻生长和抗性。因为miR168-AGO1模块调控整个miRNA网络，我们分别在水稻苗期和分蘖期收集水稻叶片，在孕穗期收集幼穗，提取RNA，进行小RNA高通量测序分析。结果显示，与对照水稻材料相比，很多miRNA的累积在OX168和MIM168中都发生了显著的改变。进一步分析发现，苗期有162个，分蘖期有156个，抽穗期有197个miRNA的表达受miR168影响。在这些被调控的miRNA中，15个miRNA已被报道参与调控水稻的生长发育[6，8-10]。同时，通过与我们原来发表的数据进行交叉比对[7]，筛选出了54个既受miR168影响，又响应稻瘟菌侵染的miRNA。在这些miRNA中，有 9 个已经被验证参与调控稻瘟病抗性[5，7，11-16]。与此相呼应，与对照材料相比，这些miRNA靶基因的表达水平在OX168和MIM168材料中也有变化。这些结果暗示，miR168-AGO1模块可能通过调控下游的miRNA累积来影响水稻生长和抗性，并且，应该有部分miRNA起关键作用。

进一步筛选可能起关键调控功能的miRNA发现，在苗期和分蘖期叶片中，miR1320的累积量在MIM168中增加，在OX168中降低。另外，在稻瘟菌侵染条件下，miR1320的累积在抗性材料IRBLkm-Ts中增加，而在感病材料LTH中降低，暗示miR1320参与了miR168对稻瘟病抗性的调控。为了验证这一猜想，我们分别构建了野生型背景下的miR1320的过表达材料（OX1320），抑制miR1320功能的转基因材料（MIM1320），以及在OX168和MIM168背景下的过表达材料（OX1320/OX168和OX1320/MIM168）。我们对上述材料进行抗性分析发现，OX1320材料稻瘟病抗性显著增强，稻瘟菌侵染进程延迟，H2O2累积和抗性相关基因的表达水平也显著提高，而MIM1320则呈现相反的表型。另外，OX1320/OX168材料的抗性显著高于OX168材料，而OX1320/MIM168抗性也显著高于MIM168。有意思的是，OX1320虽然抗性增强，但产量与对照相比无显著差异。这些结果说明，miR1320参与了对稻瘟病抗性的调控，但不影响产量。

miR156，miR529和miR535都靶定SQUAMOSA promoter binding protein-like（SPL）14。SPL14 编码一个调控水稻理想株型的蛋白IPA1，抑制水稻分蘖，但促进穗发育[8，17-18]。我们检测了这些miRNA在OX168和MIM168材料分蘖期的茎端分生组织中的累积量。miR156的累积无显著变化，miR529的累积量低于检测阈值。然而，在分蘖早期，miR535的累积在OX168中降低，在MIM168中增加；到了分蘖后期，miR535的累积在OX168和MIM168中均降低。与miR535的累积模式相反，在MIM168的茎端分生组织中，靶基因SPL14的表达在分蘖早期被抑制，在分蘖后期则被上调。这些结果暗示，miR168-AGO1模块可能通过miR535调控分蘖和穗发育。

为了进一步检测miR535在miR168-AGO1模块调控分蘖的信号通路中的作用，我们分别构建了野生型背景下的miR535的过表达材料（OX535），抑制miR535功能的转基因材料（MIM535），以及在OX168和MIM168背景下的过表达材料（OX535/OX168和OX535/MIM168）。SPL14的表达水平在OX535材料中被显著抑制，反之，在MIM535材料中显著提高，说明miR535能有效抑制SPL14的表达。OX535材料的分蘖数达到对照的2～3倍，但穗型变小，结实率下降；相反，MIM535材料的分蘖数与对照相比无显著差异，但穗型变大，每穗粒数增加，导致单株产量增加。与此一致，OX535/OX168和OX535/MIM168材料的分蘖数都显著高于其各自的背景材料OX168和MIM168。另外，MIM535抗性增强，而OX535抗性减弱。这些结果暗示，在苗期到分蘖早期的转变过程中，MIM168材料中miR535的累积增加，抑制SPL14的表达，从而促进分蘖，但影响抗性；而进入分蘖后期时，miR535累积减少，SPL14表达增加，从而抑制无效分蘖的形成，促进穗发育，并提高抗性。

我们也筛选了可能影响生育期的miRNA。测序数据显示，在抽穗期，与对照材料相比，miR164在MIM168材料中的累积降低，而在OX168中无显著差异。相反，miR164的靶基因NAC11，被报道可促进早花[19]，在MIM168材料中的表达显著增加，暗示在MIM168中，miR164在抽穗期的低累积促进了NAC11的表达，从而促进早花。为了进一步检测miR164是否真的参与miR168-AGO1模块调控生育期的信号通路，我们分别构建了野生型背景下的miR164过表达材料（OX164），抑制miR164功能的转基因材料（MIM164），以及在OX168和MIM168背景下的过表达材料（OX164/OX168和OX164/MIM168）。与对照相比，OX164材料株型变矮，花期延迟4 d左右，NAC11的表达水平显著降低；与MIM168相比，OX164/MIM168花期也延迟3 d左右；相反，MIM164材料株型基本不变，花期提前5 d左右，NAC11和开花相关基因Hd3a和RFT1的表达水平也显著提高。另外，我们还构建了NAC11的两个突变体nac11-1和nac11-2，发现这两个突变体的花期均比对照有所延迟。这些结果说明，miR164-NAC11模块参与了miR168-AGO1模块调控的水稻生育期。

同时，在苗期和抽穗期，miR164的累积在OX168中增加，而在MIM168中有所降低。与此相吻合，OX164材料的稻瘟病抗性降低，而MIM164材料的抗性增强；OX164/OX168材料的抗性显著低于OX168，而OX164/MIM168的抗性也显著低于MIM168。这些结果说明，miR164也参与了miR168-AGO1模块调控的水稻稻瘟病抗性。

作物产量与全生育期密切相关，与抗性之间也存在拮抗关系。在这一研究中，我们发现抑制miR168的功能，可以提高水稻产量，促进早花，并提高稻瘟病抗性。miR168-AGO1模块影响了整个miRNA网络。其中，通过miR1320提高稻瘟病抗性，通过miR535调控分蘖、穗发育和抗性，通过miR164控制花期和抗性（图1）。需要指出，应该还有受miR168-AGO1模块调控的其他很多miRNA也参与调控水稻产量、生育期以及抗性，这些miRNA的具体功能有待进一步研究。

图1 miR168-AGO1s模块通过3个miRNA调控水稻免疫和生长发育的模式图Figure 1 Model for miR168-AGO1s regulating rice immunity and growth through three miRNAs