四种鳃金龟对不同植物挥发物的触角电位反应

白 茹，陈 立，王文凯

(1. 长江大学农学院，湖北荆州 434025；2. 河北大学生命科学学院，生命科学与绿色发展研究院，河北保定 071002)

金龟甲属鞘翅目Coleoptera金龟甲总科Scarabaeoidea，种类繁多，分布广泛，许多种类是重要的农林害虫。鳃金龟科Melolonthidae是金龟甲总科的最大类群。已记录的该总科昆虫有3万余种，我国分布有1 800多种(魏鸿均, 1985)。蛴螬是金龟甲幼虫的通称，在土壤内隐蔽生活，食性杂，几乎为害所有植物的根系或幼苗。成虫喜食植物的叶、茎、花、果等，对农作物和林木也可造成严重危害。在我国，为害成灾的金龟有110多种(张芝利, 1984)。

华北大黑鳃金龟HolotrichiaoblitaFalderman主要分布于东北、华北、西北等地区(仵均祥, 2002)。幼虫主要为害农作物，如小麦、谷子、高粱等(陆俊姣等, 2020)；成虫取食林木、果树嫩叶，如杨、柳、榆、桑、苹果、槐、等(张国云等, 2006; 李娅娅等, 2018; 马艳华等, 2018)，成虫有趋光性，出土后尤喜在草地上群集取食交尾，5月中旬至6月中旬为成虫危害盛期。暗黑鳃金龟HolotrichiaparallelaMotschulsky分布于河北、贵州、四川等20余个省市(仵均祥, 2002)。幼虫严重危害花生、马铃薯、小麦秋苗等大田作物(冯晓洁, 2017; 刘艳涛等, 2020)；成虫主要取食危害禾本科作物、豆类、薯类、花生等，成虫有趋光性，6月下旬至7月上旬，以及8月中旬为成虫危害高峰期，局部发生量大，危害重，常需要重点防治(徐建国等, 2002; 李为争等, 2010;)。小黄鳃金龟MetabolusflavescensBrenske分布在华东、华北、东北等地区(仵均祥, 2002)。幼虫取食果树、玉米、大豆、花生的嫩根；成虫主要为害苹果、梨、丁香、花生、大豆、苗木杂草，成虫无明显趋光性，6月中旬至7月上旬为成虫盛发期(杨福田, 1991;刘广瑞等, 1997;杨映礼和刘霞, 2008)。福婆鳃金龟BrahminafaldermanniKraatz分布在辽宁、河北、山西(孙淑玲等, 2007b)。主要为害桃树、梨树、杏树、山枣、苹果和荆条等树木，成虫略有趋光性，6月至7月为活动盛期，发生量少，危害较轻(刘广瑞等, 1997)。华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟作为优势种群，在河北、山东等省为害较严重(徐建国等, 2002; 李耀发等, 2008; 罗宗秀等, 2010; 王玉彬, 2013)。

化学信号是调控昆虫聚集、求偶、觅食、产卵等行为的重要因素之一。植物挥发物是植食性昆虫定位寄主植物的重要化学信号(Kühnle and Müller, 2010; Dötterletal., 2012)。触角是昆虫感知植物挥发物的主要嗅觉器官(Dengetal., 2012; 杜潇等, 2015)。华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、小黄鳃金龟和福婆鳃金龟都有昼伏夜出习性，主要通过嗅觉定位寄主植物(Juetal., 2018; Wangetal., 2020)。触角电位(Electroantennography，EAG)技术能快速检测触角对化学物质的电生理反应(赵新成等, 2004)，已被广泛应用于测定金龟甲对植物挥发物的嗅觉感知能力(Reineckeetal., 2005; 张艳玲等, 2006; Wolde-Hawariatetal., 2007; Vutsetal., 2010; 邓思思等, 2011; 李为争等, 2013; 张国云等, 2015; 龚建等, 2017)，其结果有助于筛选出金龟甲选择、定位寄主的关键化学物质，为植物源引诱剂的开发提供重要的参考(Wolde-Hawariatetal., 2007; Chen and Li, 2011; 李晓峰等, 2020)。

本研究通过溶剂浸提法，提取6种寄主植物和1种非寄主植物银杏的粗提物，将粗提物经硅胶柱层析纯化。采用触角电位技术分别测试了华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、小黄鳃金龟和福婆鳃金龟对不同植物粗提物的EAG反应。本文关于金龟甲对不同植物提取物的电生理反应的数据结果，将有助于鉴定金龟行为反应的植物挥发性物质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试昆虫

供试昆虫包括华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟成虫、小黄鳃金龟成虫和福婆鳃金龟成虫。均采自北京市朝阳区中国科学院园区内，采集时间为每晚19 ∶00-21 ∶00。

1.1.2供试植物

因4种金龟甲对寄主的偏好略有不同，每种金龟甲的电生理实验测试的植物也略有差异。根据各金龟甲的寄主种类，华北大黑鳃金龟实验测试的植物包括银杏GinkgobilobaL.、玉兰MagnoliadenudataDesr.、柿树DiospyroskakiL.f.、金银木Loniceramaackii(Rupr.) Maxim.和榆树UlmuspumilaL.；暗黑鳃金龟实验测试的植物包括银杏、柿树、金银木、榆树和芙蓉葵HibiscusmoscheutosL.；小黄鳃金龟和福婆鳃金龟实验测试的植物均为银杏、金银木、榆树、芙蓉葵和丁香Syzygiumraromaticum(L.) Merrill & Perry。供试植株均采自中科院奥运村园区。

1.1.3试验材料与仪器

材料：22 mL样品瓶；万分之一电子天平(AR224CN)；硅胶(200～300目)；HPLC正己烷购于CNW Technologies GmbH(Düsseldorf，德国)，无水硫酸钠。

仪器：触角电位仪(Syntech，Kirchzarten，德国)。

1.2 试验方法

1.2.1溶剂提取法采集植物挥发物

挑选健康植株，取5 g新鲜叶片，剪成碎片，装进22 mL样品瓶中，加入HPLC级正己烷10 mL置于室内浸提24 h，将浸提液转移到干净的样品瓶中，并用正己烷清洗植物碎片两次，合并提取液，浓缩后得到5 mL浸提液，用2 g无水硫酸钠干燥24 h后过滤，将滤液置于冰箱中备用。

1.2.2硅胶柱层析法纯化植物提取物

为了除去植物粗提物中的非挥发性的、极性大的物质，利用硅胶柱层析方法对粗提物进行纯化。称取200 mg的200～300目硅胶为固定相装载到玻璃滴管里，然后将1 mL植物粗提物滴加到硅胶柱里，并以1 mL正己烷和4.2 mL正己烷/丙酮(5 ∶1)混合溶剂为洗脱剂进行分离。每2 mL收集一次，收集3个流分(F1、F2、F3)，预实验结果表明，第一、三流分(F1，F3)EAG反应较小，第二个流分(F2)的EAG活性强，所以选择F2进行触角电位活性测试。

1.2.3触角电位测定

测定所用的设备和技术参考李娅娅等(2018)和Chen等(2019)。充满导电液(内含750 mg/mL NaCl，35 mg/mL KCl，29 mg/mL CaCl2·2H2O，0.05%吐温80的水溶液)的毛细管作为电极。将金龟甲的触角切下，切口端与参比电极相连，触角顶端套入记录电极。利用铂金丝连接电极和信号放大器，信号通过探针(EAG COMBI，Syntech，Kirchzarten，Germany)监测，使用EAG 2000软件(Syntech，Kirchzarten，Germany)记录和分析数据。取10 μL待测样品，均匀地滴在60 mm×5 mm滤纸条上，待溶剂挥发15 s后放入玻璃巴斯德管中，密闭平衡40 s后用于刺激。

使用植物粗提物和硅胶柱层析流分F2测试金龟的触角电位反应，HPLC正己烷作空白对照，校正样品的EAG值。按随机方式测试样品，每次刺激时间为0.2 s，刺激间隔为2 min，湿润空气的流速为1 000 mL/min。

1.3 数据分析

分析所用数据均为样品EAG反应绝对值(absolute EAG response)，即将样品EAG测量值减去空白对照测量值的平均值。利用Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据分析，金龟甲的EAG反应绝对值(平均值±标准误，n=7)，同一性别对不同测试样品的EAG反应采用Tukey-HSD检验比较差异显著性(P<0.05)，不同性别对同种测试样品的EAG反应采用t-检验比较差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 4种金龟对植物粗提物的EAG反应

2.1.1华北大黑鳃金龟对植物粗提物的EAG反应

华北大黑鳃金龟雄、雌虫对5种植物粗提物均有明显EAG反应如图1所示。华北大黑鳃金龟雄虫对不同植物粗提物的EAG反应无差异；雌虫对玉兰粗提物的EAG反应最大，其次是金银木和榆树，而对银杏粗提物的EAG反应最小，显著低于玉兰和金银木。

图1 华北大黑鳃金龟对不同植物粗提物的EAG反应Fig.1 EAG responses of Holotrichia oblita to the different plant extracts注：不同小写字母表示雌虫对不同植物粗提物EAG反应的差异显著(P<0.05)。雄、雌虫对同一种植物粗提物EAG反应差异：“*”表示有显著差异(P<0.05)；“**”表示有极显著差异(P<0.01)，下同。Note: Different lower case letters indicated significant difference in EAG response of female beetles to different plant extracts (P<0.05). Differences in the EAG response of female and male to the same plant extract: “*” indicated significant difference (P<0.05); “**” indicated a very significant difference (P<0.01), the same below.

华北大黑鳃金龟雄虫对5种植物粗提物的EAG反应均比雌虫小，除了对非寄主植物银杏外，雄、雌虫对4种寄主植物粗提物的EAG反应均存在极显著差异。

2.1.2暗黑鳃金龟对植物粗提物的EAG反应

在对5种植物粗提物的EAG测试中(图2)，暗黑鳃金龟雄、雌虫对金银木粗提物EAG反应最大，对芙蓉葵粗提物EAG反应最小。雌虫对5种植物的EAG反应无显著性差异(P>0.05)。雄虫对金银木和榆树粗提物的EAG反应值显著高于芙蓉葵粗提物。银杏、柿树和芙蓉葵粗提物所引起的EAG反应无显著性差异。雄、雌虫对同种植物粗提物的EAG反应均无显著性差异。

图2 暗黑鳃金龟对不同植物粗提物的EAG反应Fig. 2 EAG responses of Holotrichia parallela to the different plant extracts注：不同大写字母表示雄虫对不同植物粗提物EAG反应的差异显著(P<0.05)，下同。Note: Different capital case letters indicated significant difference in EAG response of male beetles to different plant extracts (P<0.05), the same below.

2.1.3小黄鳃金龟对植物粗提物的EAG反应

小黄鳃金龟雄、雌虫对5种植物粗提物均有明显的EAG反应(图3)。雄虫对银杏、金银木、榆树和丁香4种植物粗提物的EAG反应均比芙蓉葵大，与芙蓉葵粗提物具有显著性差异(P<0.05)，但4种粗提物间差异均不显著(P>0.05)；雌虫对金银木和榆树粗提物的EAG反应较大，其次是银杏和丁香，而对芙蓉葵的EAG反应最小，金银木、榆树和芙蓉葵粗提物间有显著性差异(P<0.05)。

图3 小黄鳃金龟对不同植物粗提物的EAG反应Fig.3 EAG responses of Metabolus flavescens to the different plant extracts

雌虫对5种植物粗提物的EAG反应均比雄虫大，但雄、雌虫除了对芙蓉葵粗提物的EAG反应达极显著差异外，对其他4种植物粗提物EAG反应差异均不显著(P>0.05)。

2.1.4福婆鳃金龟对植物粗提物的EAG反应

5种植物粗提物均能引起雄、雌虫的EAG反应(图4)。雄、雌虫对5种植物的EAG反应无显著差异(P>0.05)。雄、雌虫对同种植物粗提物的EAG反应也均无显著性差异(P>0.05)。

图4 福婆鳃金龟对不同植物粗提物的EAG反应Fig.4 EAG responses of Brahmina faldermanni to the different plant extracts

2.2 两种金龟雌虫对纯化的F2流分的EAG反应

2.2.1华北大黑鳃金龟雌虫对纯化的F2流分的EAG反应

华北大黑鳃金龟雌虫对5种植物粗提物的F2流分均有明显的EAG反应(图5)。其中对金银木F2流分的EAG反应最大，其次是榆树、柿树和玉兰，而对银杏的EAG反应最小，显著低于金银木的EAG反应。

图5 华北大黑鳃金龟雌虫对纯化的F2流分的EAG反应Fig. 5 EAG responses of female Holotrichia oblita to Fraction 2 of the plant extracts

2.2.2暗黑鳃金龟雌虫对纯化的F2流分的EAG反应

暗黑鳃金龟雌虫对5种植物的F2流分的EAG反应略有差异(图6)，但未达到显著水平(P>0.05)。

图6 暗黑鳃金龟雌性对纯化的F2流分的EAG反应Fig.6 EAG responses of female Holotrichia parallela to Fraction 2 of the plant extracts

3 结论与讨论

本研究测定了华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、小黄鳃金龟和福婆鳃金龟对7种植物绿叶粗提物的EAG反应。华北大黑鳃金龟雌虫对玉兰、柿树、金银木和榆树粗提物产生的EAG反应均极显著大于雄虫，小黄鳃金龟雌虫对芙蓉葵粗提物的EAG反应极显著大于雄虫，而其它两种鳃金龟的EAG反应均不存在性别间的差异。华北大黑鳃金龟雌虫对所有植物粗提物的EAG反应均大于雄虫，可能是由于雄、雌触角感器的数量、类型和分布的差异，导致触角对植物挥发物的敏感性存在性别差异，也可能是与雄、雌金龟触角感器的气味结合蛋白的功能差异有关(孙凡等, 2007a; 杜潇等, 2015; 刘玲等, 2015; 张国云等, 2016; 衣建坤, 2019)。

华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、小黄鳃金龟和福婆鳃金龟在不同寄主植物上的分布和为害情况，说明金龟甲对不同的寄主植物存在偏好性，这种偏好性可能与植物挥发物的种类和含量有关；也有可能与金龟的营养代谢有关(李娅娅等, 2018)。4种鳃金龟对共同寄主植物榆树和金银木粗提物的EAG反应都比较大；华北大黑鳃金龟对玉兰粗提物的EAG反应偏大，但对玉兰提取物的F2流分的EAG反应偏小，这可能是因为玉兰中的某些植物源挥发物因极性过大未被洗脱下来。暗黑鳃金龟偏好榆树，且对其粗提物的EAG反应也较大，对芙蓉葵粗提物的EAG反应最小，可能是因为芙蓉葵产生的植物源挥发物的含量比其他寄主植物小。小黄鳃金龟偏好金银木、榆树和丁香，对这些植物粗提物的EAG反应也较大。福婆鳃金龟的田间发生量较少，对植物粗提物的EAG反应也小于其他金龟甲，可能是其嗅觉敏感性较低。

华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、小黄鳃金龟和福婆鳃金龟对银杏、玉兰、柿树、金银木、榆树、芙蓉葵、丁香的顶空挥发物有明显的EAG反应(李娅娅等, 2018)。华北大黑鳃金龟雄、雌虫对植物粗提物的EAG反应数值范围分别为(0.40～0.66 mV)、(0.71～1.72 mV)，要明显高于植物顶空挥发物(雄虫：0.2～0.34 mV, 雌虫：0.3～0.72 mV)，说明溶剂提取法比动态顶空吸附法提取更多的活性挥发物；相反，福婆鳃金龟雄、雌虫对植物顶空挥发物的EAG反应数值范围分别为(0.76～2.53 mV)、(0.76～2.99 mV)，要低于植物粗提物(0.73～0.94 mV, 0.76～0.88 mV)，说明这些寄主植物能释放易挥发的活性挥发物。而暗黑鳃金龟和小黄鳃金龟雄、雌虫对不同植物的粗提物的EAG反应数值范围(暗黑鳃金龟雄虫：1.22～2.92 mV, 雌虫：1.47～2.82 mV; 小黄鳃金龟雄虫：0.84～2.18 mV, 雌虫：1.34～2.31 mV)与顶空挥发物(暗黑鳃金龟雄虫：0.99～2.62 mV, 雌虫：1.04～2.67 mV; 小黄鳃金龟雄虫：0.59～1.19 mV, 雌虫：0.69～1.66 mV)基本一致，说明溶剂提取法和动态顶空吸附法都可以提取到活性挥发物。华北大黑鳃金龟雌虫对植物粗提物F2流分(0.72～1.64 mV)的EAG反应数值范围明显大于植物顶空挥发物。虽然暗黑鳃金龟雌虫对植物粗提物F2流分的EAG反应数值范围(1.34～2.04 mV)小于F2流分植物顶空挥发物，但是都在1.0 mV以上，完全可以进行气相色谱-触角电位(Gas chromatography-Electroantennography，GC-EAD)分析。因此，可以采用溶剂提取法提取植物挥发物，经硅胶柱层析纯化得到活性流分，直接进行气相色谱-触角电位测试。和动态顶空吸附法相比，溶剂提取法需要的样品量少，操作简单，用时短。本研究探索了一种新的植物挥发物提取方法，为后续植物挥发物引诱活性成分鉴定，开发金龟甲引诱剂打下了良好的基础。

昆虫对某些植物挥发物的EAG反应大小与行为反应相一致。如大豆挥发物1-辛烯-3-醇能引起中华弧丽金龟Popilliaquadriguttata雌成虫较强的EAG反应，且对雌成虫有显著的引诱作用(徐伟等, 2018)。桃树挥发物中的反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇能引起东方绢金龟Maladeraorientalis雌成虫的触角电位反应，且有显著的吸引作用(张萌萌等, 2020)。东北大黑鳃金龟雌、雄成虫对绿叶气味中的反-2-己烯醛均有较强的的EAG反应，也有定向作用(孙凡等, 2007a)。铜绿丽金龟Anomalacorpulenta对水杨酸甲酯、顺-3-己烯乙酸酯和石竹烯均有较强的EAG反应，且行为选择反应明显(鞠倩等, 2016)。当然，也有一些植物挥发物引起的两种反应则可能表现为不相关甚至负相关(郭线茹等, 2003)。如非寄主植物挥发物2-苯乙醇能引起中华弧丽金龟的雄成虫较强的EAG反应；但行为生测结果表明，2-苯乙醇对中华弧丽金龟雄成虫既无引诱作用，也无驱避作用(徐伟等, 2018)。因此不能仅依据EAG反应推测行为反应，研究金龟对活性物质的反应，还需进行田间试验进一步验证和筛选。