自体外周血单个核细胞宫腔灌注对反复种植失败患者妊娠结局的影响

雷利娜 张镛镛 路莉娟

河南科技大学第一附属医院(洛阳，471000)

近年来，随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术进步，不孕症患者助孕后的临床妊娠率也有了大幅提高，但在IVF-ET治疗过程中，仍有些患者在进行多次胚胎移植后不能成功妊娠，临床称之为反复种植失败(RIF)[1]。此类患者通常有高质量胚胎，胚胎反复着床失败主要与子宫内膜容受性差有关。积极改善RIF患者的子宫内膜容受性，对提高助孕成功具有重大意义。国外有研究显示[2]，宫腔灌注自体外周血单个核细胞(PBMCs)可有效提高RIF患者的临床妊娠率；还有研究指出[3]PBMCs宫腔灌注后的子宫内膜表现呈非感染性炎性反应，可通过子宫内膜分泌的各种蛋白酶，改变子宫内膜上皮细胞的表达功能，从而提高患者子宫内膜容受性。同时该治疗方法还可促进滋养细胞侵入，为胚胎种植提供良好环境，使得胚胎种植更容易。本院在RIF患者的IVF-ET治疗中采用自体PBMCs宫腔灌注取得良好效果。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年6月—2019年6月在本院生殖中心接诊的80例RIF不孕症患者作为研究对象。纳入标准：①符合RIF诊断[4]；②年龄<40岁；③血清卵泡刺激素(FSH)<15U/L；④夫妻双方染色体核型无异常；⑤患者自愿参与研究并签署知情同意书。排除标准：①单侧或双侧输卵管积水、宫腔积液者；②合并子宫畸形、子宫器质性病变者；③合并子宫内膜炎者；④子宫内膜结核或子宫内膜异位症者。使用随机数字表法分为对照组和观察组各40例。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 治疗方法

1.2.1 PBMCs宫腔灌注观察组患者在冷冻胚胎移植前1天进行自体PBMCs宫腔灌注。抽取患者外周静脉血4ml，使用淋巴细胞分离液分离血中PBMCs，生理盐水洗涤2次，再将PBMCs溶液重悬至200μl，放置在1.5ml无菌离心管中备用。使用0.1%碘伏冲洗患者外阴及阴道后，人工授精管与注射器(1ml)相连抽取PBMCs，然后将人工授精管置入宫腔内，将PBMCs缓慢推注进宫腔内并停留5s，再退出人工授精管。宫腔灌注后，患者卧床10～15min。对照组行胚胎移植前不进行PBMCs宫腔灌注。

1.2.2胚胎冷冻与复苏使用SAGE公司生产的玻璃化冷冻/解冻液和日本Kitazato公司生产Cryotop冷冻载体对卵裂期胚胎进行冷冻和解冻。复苏胚胎卵裂球数目≥冷冻胚胎卵裂球数目的1/2则判定为复苏胚胎存活。

1.2.3内膜准备与胚胎移植使用Peter卵裂期胚胎评分系统对卵裂期胚胎分级：卵裂球数>7个，碎片数量<10%为Ⅰ级；卵裂球数>7个，碎片10%～20%为Ⅱ级；卵裂球数>7个，碎片20%～30%，或卵裂球数5～6个而碎片<10%为Ⅲ级；卵裂球数>7个，碎片>30%，或卵裂球数5～6个而碎片>10%，或卵裂球数<5个为Ⅳ级。Ⅰ～Ⅱ级胚胎即为优质胚胎。月经规律、排卵正常，或子宫内膜厚度>8mm者采用自然周期；月经不规律、排卵异常，或者子宫内膜厚度<8mm者采用人工周期。B超引导下行胚胎移植，移植后14d检测血清人绒毛膜促性腺激素(hCG)水平，阳性则判定为生化妊娠持续监测血清HCG水平，胚胎移植1个月后超声检查，宫腔内探及孕囊或胎心搏动即判定为临床妊娠。

1.3 观察指标

①宫腔灌注前后采集观察组宫颈管内分泌物，酶联免疫吸附法测定白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子(TNF-α)水平。②常规取卵后3d对两组子宫内膜取样，体外培养24h后，更换含雌孕激素培养液(1ml)为D0日，体外培养48h(D2日)后，观察组加入0.5ml PBMCs细胞悬液，对照组加入等量培养液继续培养至第6天。体外培养期间，每48h更换0.5ml培养液，收集D1、D3、D5日培养液-20℃保存待检，酶联免疫法测定培养液中的白血病抑制因子(LIF)、整合素αvβ3水平。②记录两组妊娠结局，包括胚胎种植率、临床妊娠率、流产率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 基线资料

两组年龄、血清FSH水平、取卵周期数、移植胚胎数、移植优胚数、移植日内膜厚度比较均无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 宫颈管内分泌物IL-6、TNF-α水平

观察组宫腔灌注后宫颈管内分泌物中IL-6水平(355.85±65.74 ng/L)高于灌注前(94.80±16.69 ng/L)，TNF-α水平(14.29±1.78 ng/L)低于灌注前(17.20±1.86 ng/L)(P<0.05)。

2.3培养液中LIF、整合素αvβ3水平

两组D1、D3日培养液中LIF、整合素αvβ3水平比较无差异(P>0.05)；与D1、D3日相比，观察组D5日的LIF及整合素αvβ3水平均明显提高且高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组不同时间培养液中LIF、整合素αvβ3水平比较

2.4 妊娠结局比较

观察组胚胎种植率、临床妊娠率均高于对照组(P<0.05)，流产率两组无差异(P>0.05)。见表3。

表3 两组妊娠结局比较[例(%)]

3 讨论

RIF是辅助生殖技术领域的一大难题，研究显示2/3以上的胚胎种植失败与子宫内膜容受性异常有关[5]。种植窗期一般在排卵后6d开始，持续4d左右。目前，临床主要通过药物、内膜搔刮刺激、宫腹腔镜手术等方式来改善子宫内膜容受性，从而改善患者妊娠结局，但也存在药物不良反应严重，且采用手术治疗存在机械刺激创伤和术后疼痛严重等缺点[6]。有研究报道，RIF患者行自体PBMC宫腔灌注治疗后胚胎种植率显著提高，其作用机制可能与患者子宫内膜容受性相关细胞因子表达改善有关。

临床根据产生细胞因子类型的不同将辅助T淋巴细胞分为Th1、Th2两类，其中Th1细胞产生的TNF-α、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-12等细胞因子介导细胞免疫过程，Th2细胞产生的IL-4、IL-6、IL-13等细胞因子参与体液免疫过程。研究发现[8]，IL-6缺陷小鼠的植入位点明显减少，生育能力较差，提示IL-6在胚胎植入过程中发挥着重要作用，其主要参与子宫内膜蜕膜化、血管生成、组织重塑、胎盘发育、滋养层分化等过程。TNF-α是保证子宫内膜容受性所不可或缺的细胞因子，表达过低可能减少黏附分子表达，影响子宫内膜血管生成，从而造成胚胎无法正常黏附、侵袭；表达过高则会抑制子宫内膜的蜕膜化进程，缩短上皮细胞存活时间，导致炎性细胞因子增加，从而抑制滋养细胞融合及激素生成，最终促进子宫内膜细胞凋亡[9-10]。有研究指出[11]，相比未妊娠女性，妊娠女性的促炎细胞因子水平明显更高，而复发性流产患者的促炎细胞因子水平更高。本次研究显示，与宫腔灌注前相比，观察组宫腔灌注后宫颈管内分泌物中的IL-6水平明显升高、TNF-α水平明显降低。与相关文献[12]结论相符。说明PBMCs宫腔灌注治疗可能调节患者Th2/Th1平衡，诱导局部免疫平衡向Th2倾斜，改善局部促炎环境，以利于胚胎植入及血管生成。

LIF和整合素αvβ3均参与胚胎着床过程，被认为是评估子宫内膜容受性的标志性分子。国内文献指出[13]，RIF患者种植窗期子宫内膜整合素αvβ及其受体均呈低表达。另有动物实验研究显示[14]，对着床障碍小鼠进行PBMC宫腔灌注后，血管内皮生长因子(VEGF)及LIF表达水平均明显提高，子宫内膜容受性得到明显改善。本研究中，对子宫内膜细胞培养液检测发现，随着培养时间延长，LIF和整合素αvβ3水平均明显升高，且观察组D5日αvβ3水平高于对照组。表明在体外培养条件下，RIF患者的自体PBMC能够有效促进子宫内膜细胞LIF及整合素αvβ3表达，从而提高子宫内膜容受性。本次研究观察组胚胎种植率、临床妊娠率均高于对照组。与项云改等[15]结论相符。说明自体PBMC宫腔灌注能够通过调节子宫内膜容受性、Th1/Th2免疫平衡来提高RIF患者的临床妊娠率，改善妊娠结局。

综上所述，RIF不孕症患者在进行胚胎移植前进行自体PBMCs宫腔灌注能够有效改善子宫内膜容受性，调节Th1/Th2免疫平衡，提高胚胎种植率及妊娠成功率。但本研究纳入样本量较小，结论还有待大样本研究予以验证。