基于近红外分析技术快速测定灯盏花素注射液的含量

（陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

灯盏花系菊科正蓬属植物，具有解表散寒、活血化瘀、疏经活络、止痛消积等作用。灯盏花素提取自灯盏花，主要成分为灯盏乙素，灯盏花素注射液为灯盏花素的灭菌水溶液，功能主治为活血化瘀，通络止痛，用于中风后遗症、冠心病、心绞痛，在心脑血管疾病中应用广泛[1-2]。灯盏花素注射液现执行《中药成方制剂》第20册标准，采用紫外吸收系数法测定其含量[3]，耗费的仪器、人力、时间成本较大，且无法进行现场检测。为解决这些问题，本文提出一种快速测定灯盏花素注射液含量的方法，以解决偏远地区药品检测问题，应对自然灾害、突发性公共卫生事件现场的药品快速检测。

近红外光谱分析技术在分类鉴别、含量确定、在线检测等方面具有无可比拟的优势[4-6]。本文通过将近红外透反射光谱分析技术和偏最小二乘算法（PLS）相结合，构建了灯盏花素注射液快速定量分析模型，并对模型进行了优化和验证，以开拓中药注射液在快速定量分析方面的应用。

1 仪器及试药

1.1 仪器

Matrix-F型近红外光谱仪（德国布鲁克公司），配备有1.5 m固体光纤探头和1号（光程1 mm）液体测样附件；铟镓砷（In，Ga，As）检测器；5.0版本OPUS分析软件（德国布鲁克公司）及定量2软件包；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；UV-2600紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 样品

2个厂家27批灯盏花素注射液，均为本单位抽验样品；同时，通过稀释的方法在实验室自制了54个不同浓度梯度的样品。

2 方法

2.1 含量测定

根据《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》标准，采用紫外吸收法测定灯盏花素注射液中灯盏花素（以灯盏花素乙素计）含量[3]。

2.2 测定近红外光谱

近红外光谱采集的波数范围为12 000～4 000 cm-1，分辨率为8 cm-1，室温。实验采样方式为透反射。借助固体光纤探头及1号（光程1 mm）液体采样附件, 通过将样品滴加到采样附件的方式测定样品的近红外光谱。每批样品选用6瓶测定原始光谱，并求平均光谱作为建模光谱。

2.3 建立定量模型

建模选用的OPUS5.0分析软件及附带定量2软件包的基本原理是PLS，用交叉验证均方根误差（RMSECV）评价建模准确性，其具体数学表达如下。

其中，Nc、CVi和Yi分别表示校正集样品数量、交叉验证中样品i的预测值和真实测定值。

2.4 模型验证

2.4.1 准确性 选取未参与建模的20批来自2个生产企业的灯盏花素注射液，验证模型准确性。通过比较近红外光谱预测值与真值的偏差及将预测值与真值在95 %的置信区间内进行配对t-检验，评价模型准确性。

2.4.2 专属性 偏最小二乘校正模型的溢出值用马氏距离[7]衡量，并进行专属性评价，其计算方法如下。

其中，MD、Xi和Xj、、S分别表示马氏距离、原始数据、元素平均值和基于建模所选PLS矢量数的协方差。

灯盏花素注射液的定量模型限定值（Threshold）按下式计算，结果为0.17。

其中，Rank表示PLS矢量数，为7；M表示建模样本数，为81；Factor为2。

实验选择10批灯盏花素注射液（S）及3批相同剂型的丹参酮注射液（T）进行模型专属性测试，将测得的马氏距离与模型限定值进行比较，评价模型的专属性。

2.4.3 线性 将81批建模样品的真值与近红外预测值做线性回归，评价方法的相关性。

2.4.4 精密度 通过重复性和中间精密度评价所建方法的精密度。同一操作者对同一样品在同一天内重复测定6次，通过置信区间和标准偏差评价重复性；两个操作者对同一样品在3 d内各重复测定3次，通过置信区间及方差分析评价中间精密度。

3 结果与讨论

3.1 校正集、验证集样品的选择

内部交叉验证法适用于建模样品数量小于100批时的建模[8-9]。本研究中样本81批次，故将所有样品作为校正集用于模型建立。81批次样品的含量分布见图1。

图1 81批次样品的含量分布

3.2 近红外光谱校正模型

为了突出活性成分的信息，建立稳健、准确的近红外光谱校正模型，我们选取了特定的谱段、适合的光谱预处理方法。

3.2.1 建模谱段的选择 近红外光谱中波数大于10 000 cm-1部分属于末端吸收，其强度很弱且会形成噪音干扰，而波数小于4200 cm-1部分由于边缘效应和噪音的存在易形成干扰，通常建模时不选择这两个区域[10-11]。水的合频吸收波数约在5155 cm-1处，其呈现出宽频带高峰值特点，建模时同样不予考虑[12-13]。

以RMSECV、R2及Rank值为评价标准，进行近红外光谱模型的谱段敏感性分析，并参考OPUS软件的自动优化结果，优化确定的建模谱段为7502～5446 cm-1和4602～4247 cm-1，该谱段所建立的模型RMSECV最小，R2最大，Rank值在6～10之间。由表1可见，模型1对应的谱段为最优谱段。本研究中保留的建模谱段为7502～5446 cm-1和4602～4247 cm-1，见图2。

图2 建模所选择的谱段范围

表1 不同谱段建立模型结果对比

3.2.2 光谱预处理 一阶导+矢量归一化的预处理方法一方面可提高活性成分相关的光谱吸收信息，降低光谱平移的影响；另一方面，可提高分辨率和灵敏度，同时改善背景信息干扰，分辨重叠峰。而平滑处理可有效地消除光谱噪声[14-15]。本研究中采用一阶导+矢量归一化+17点平滑的预处理方法，样品的原始光谱见图3，经预处理后的光谱见图4。由图3、图4可见，预处理降低了原始光谱的背景和噪声干扰，增强了光谱特征，提高了信噪比。

图3 建模样品的原始光谱

图4 预处理后的近红外漫反射光谱

3.2.3 确定最优模型 通过内部交叉验证、模型稳健性理论及OPUS软件自动优化结果的比较，多次优化所确定的最优模型参数见表2。内部交叉验证相关性结果见图5、图6。

表2 多次优化确定最优模型参数

图5 灯盏花素注射液近红外定量模型内部交叉验证结果

图6 灯盏花素注射液近红外定量模型RMSECV和Rank相关性图

3.3 模型验证结果

3.3.1 准确性 结果见表3。近红外光谱预测值与真实值相比较，最小绝对偏差为0.01 mg/ml，最大绝对偏差为0.21 mg/ml，平均偏差为0.08 mg/ml；最小相对偏差为0.5 %，最大相对偏差4.7 %，平均相对偏差为2.3 %。通常，近红外快检方法的偏差上限要求为5 %，因此，本次所建立的模型对验证集的预测误差均满足快检要求。进一步，将验证集的预测值与真实值在95 %的置信区间内进行配对t-检验的结果显示，在95 %的置信区间内，P值为1.691，大于0.05，这说明表明本次建模的预测结果与法定方法没有明显差别。

表3 模型对样品集的预测结果

3.3.2 专属性 结果见表4。所有样品的马氏距离均小于0.17，全部通过测试。所有样品的马氏距离均大于模型限定值，全部未通过测试，详见表4，说明本次所建立的灯盏花素注射液定量模型专属性良好。

表4 模型专属性

3.3.3 线性 本研究所建立方法的线性方程为：Y=0.9486X+0.31，r=0.994，r越接近1表明预测值越接近于真实值。近红外二级方法，通常r大于0.95即可满足近红外快检要求，故本方法的线性良好。

3.3.4 精密度 本文以重复性和中间精密度两方面评价精密度。重复性试验中，真实值为2.1126 mg/ml，6次测定的平均值为2.1071 mg/ml，标准偏差为0.17 mg/ml，置信区间1.9272～2.2781 mg/ml。中间精密度试验中，真实值为2.1021 mg/ml，6次结果的平均值为2.1953 mg/ml，标准偏差为1.2 mg/ml，对测定结果进行方差分析，得P＞0.05。以上结果表明所建方法的精密度良好。

4 结论

本研究基于近红外光谱分析技术结合PLS建立了快速测定灯盏花素注射液含量的方法。所建模型可对全国范围内不同生产企业的灯盏花素注射液进行定性和定量。中药注射液含量较低，且建模样本含量范围较窄，通过实验室自制补充了梯度浓度的样品，最终所建模型的预测准确性及耐用性均良好，适用于药品快速筛查及一线药品质量控制，具有推广应用价值。同时为近红外光谱分析技术在中药注射液定量分析方面的应用提供了参考。