Bx7OE及Dx5+Dy10优质亚基在小麦品质育种中的应用

刘 丹,梁 丹,王丽娜,朱 铭,张 明,李素敏, 胡亚南,王从磊,时晓伟,冯 刚,王建贺

(1.天津市农作物研究所，天津市农作物遗传育种重点实验室，天津 300384；2.周口市农业科学院， 河南周口 466000；3.唐山师范学院 生命科学系，河北唐山 063000)

中国强筋小麦育种起步较晚，近年来育成品种中大多数为中筋品种，强筋小麦品种占比较小，且推广面积较小。目前，国内大多数强筋小麦品种品质指标与国际强筋小麦如加麦、美国DNS还有差距，不能满足面粉企业的要求[1]。只有少部分如‘师栾02-1’‘济南17’‘新麦26’和‘中麦578’等冬小麦品种能够达到面粉企业的要求[2-5]。选育强筋冬小麦品种，使国内强筋小麦种植面积提高，其品质达到美国、加拿大等国强筋小麦的标准，可缓解中国优质小麦原粮过度依赖进口的难题。

天津市农作物研究所育成的春小麦品种‘津强1号’为引自加拿大的‘CSR17’的变异株系，品质达到强筋小麦标准，可替代进口强筋面粉[6]，亚基分析表明，‘津强1号’品种中含有的优质亚基Bx7OE及Dx5+Dy10，对津强系列高筋品质起到重要的作用。笔者课题组通过前期分子标记和谷蛋白SDS-PAGE分析发现，中国的冬小麦中部分品种存在Dx5+Dy10亚基，但未发现含有Bx7OE亚基的材料，因此可以通过导入Bx7OE亚基及Dx5+Dy10亚基对冬小麦品种的品质进行改良提升。

研究表明，麦谷蛋白占小麦籽粒蛋白总量的40%左右，与小麦醇溶蛋白通过蛋白质之间的相互作用形成面筋[7]，其中谷蛋白决定了面团的弹性，醇溶蛋白决定了面团的延展性和粘性[8]。谷蛋白在SDS-PAGE电泳中的迁移速率可分为高分子质量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子质量谷蛋白亚基(LMW-GS)[9-12]。高分子质量谷蛋白亚基对品质的贡献不尽相同，对强筋品质起到了正向作用的5+10亚基为优质亚基[13-14]，而2+12对强筋品质起到了负调作用[15]；优质亚基Bx7OE研究发现，该亚基的存在使得小麦品质显著提升，其作用机理为染色体上存在两个串联的Bx7亚基，两个编码Bx7亚基基因中存在一个逆转座子(LTR)，改变了染色体结构，导致Bx7亚基的超量表达(Bx7OE亚基)[16- 17]。美国、加拿大优质小麦中普遍存在Bx7OE亚基，并且在育种中广泛利用，部分国家已经将Bx7OE亚基作为主要育种目标。根据LTR逆转座子边界与重复片段的结合区域设计了检测Bx7OE的STS标记，可以准确检测Bx7OE是否存在[18]。

天津市农作物研究所小麦中心，利用‘津强1号’(谷蛋白亚基为“2*、Bx7OE+By8、Dx5+Dy10亚基”)为母本[19]、‘济麦22’(高分子量谷蛋白亚基为null、7+8、4+12亚基)为父本进行人工杂交，用Bx7OE+8、5+10亚基替代‘济麦22’的7+8、4+12亚基，并在F2代中筛选农艺性状倾向于‘济麦22’的后代，并对F3代通过STS标记对Bx7OE+8、5+10亚基进行筛选，保留Bx7OE+8、5+10亚基，以‘津强1号/济麦22’组合为模式，探讨Bx7OE+8、5+10亚基导入高产冬小麦品种，提升冬小麦品质，为后续进一步提升冬小麦品质提供理论依据及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

春小麦‘津强1号’与冬小麦‘济麦22’人工杂交的F3代，F1代种植于天津市农作物研究所大棚，F2代种植于天津市农作物有研究所云南元谋南繁基地，F3代为籽粒，水培萌发于天津市农作物研究所人工气候培养箱。

1.2 试验方法

F2代单穗收获种子，每穗种子中随机挑选3粒种子，25 ℃,12 h光照，12 h黑暗培养，萌发至一心一叶期，将3粒种子萌发的叶片混合取样于2 mL 离心管中，液氮研磨，加入600 μL CTAB，65 ℃提取40 min，期间每10 min颠倒混匀1次；加入600 μL 氯仿，上下颠倒混匀 10 min，12 000 r/min 离心10 min；将上清液转移到新的1.5 mL离心管中，并加入等体积的异丙醇，轻柔混匀， -20 ℃冷却2 h，4 ℃离心，12 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入体积分数为70%乙醇，4 ℃， 12 000 r/min，离心10 min，通风橱内过夜干燥，加入100 μL ddH2O，溶解DNA，-20 ℃保存。

使用2×TaqPCR Mastermix(KT201，北京，天根生化科技)，Bx7OESTS标记[20]及Dx5 STS标记[21]检测群体的优质亚基。使用10 μL体系进行PCR扩增，其中DNA模板50 ng，正反向引物各1 μL，2×TaqPCR Mastermix 5 μL，ddH2O补足至10 μL。PCR程序为预变性 94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火58 ℃，延伸72 ℃ ，1 min，30个循环；大延伸72 ℃,5 min。15 g/L琼脂糖，120 V，电泳40 min。

采用Excel 2016对数据进行统计，采用Powermarker[22]对标记类群进行划分。

2 结果与分析

2.1 Bx7OE分析

对筛选农艺性状较好且接近‘济麦22’的F2代，进行单穗收获，得到59份F3代，利用Bx7OE亚基产生机制所在的转座子STS标记(TaBACl215C06-F2467和TaBACl215C06- R25515)检测59个F3代材料，33个材料中检测到了Bx7OE亚基(图1)，占检测群体的55.93%，说明Bx7OE亚基导入冬麦的比例较高。

2.2 Dx5分析

利用编码Dx5亚基基因的STS标记(5′-CGTCCCTATAAAAGCCTAGC-3′和5′-AGTATGAAACCTGCTGCGGAC-3′)对上述59个样本进行检测，在41个样本中检测到Dx5亚基(图2)，占总检测样本的69.49%，Dx5亚基导入冬麦的比例高于Bx7OE亚基。

2.3 Bx7OE亚基及Dx5亚基导入比例分析

在59个检测样本中，33份样本存在Bx7OE亚基，41份样本存在Dx5亚基，上述样本中的27份样本既存在Bx7OE亚基也存在Dx5亚基，占总测试样本的45.76%。同时，存在12个样本检测不到Bx7OE亚基及Dx5亚基的标记(图3)。说明Bx7OE亚基及Dx5亚基同时导入‘济麦22’的比例较高。

2.4 籽粒性状及优质亚基联合筛选

在育种实践中，农民及面粉企业更倾向于种植及收购籽粒为“白色”的小麦种子及原粮，即“白粒”小麦品种。因此，F3代材料中以籽粒颜色进行了后代筛选，重点专注于“白粒”后代，结合Bx7OE亚基及Dx5亚基分子标记检测结果，发现仅9个受检材料籽粒为“白粒”，在9个白粒材料中，V21、V27、V29中既含有Bx7OE亚基又含有Dx5亚基，V24仅含有Bx7OE亚基，V22、V25、V28、V30中仅含有Dx5亚基，V23中不含Bx7OE亚基和Dx5亚基(图4)。

2.5 小麦籽粒颜色及Bx7OE亚基和Dx5亚基编码基因的遗传特性

通过对F1代籽粒颜色调查发现，F1代均表现为红色籽粒。说明‘津强1号’的籽粒颜色红色为显性性状，‘济麦22’的白色籽粒为隐性性状，因此，在F3代中，红色籽粒显著高于白色籽粒。

通过对Bx7OE亚基、Dx5亚基编码基因的序列比对分析，编码这两个基因的座位位于小麦第1同源群的B、D染色体上(图5)，与已知的小麦控制籽粒颜色的基因不在同一个同源群上，独立分离。

3 讨论与结论

编码高分子量谷蛋白的基因位于小麦基因组的第一同源群的A、B、D染色体长臂上，由复等位基因控制，两个基因在同一条染色体上连锁遗传[23]。在普通小麦的基因组上，编码HMW-GS的基因分别位于Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点，每个位点编码两个HMW-GS的亚基，按照分子量大小分为x、y亚基。其中x亚基分子量较大，y亚基分子量较小[24]。由于小麦中存在基因沉默现象，在大部分栽培小麦中Glu-A1y通常处于沉默状态[25]，Glu-B1y有时也不能表达。在普通栽培小麦种中只有4个或者5个HMW-GS亚基表达。且Dx5与Dy10连锁，Dx5与Dy10共同存在，因此仅检测Dx5就可以代表这个基因座位的导入情况。但是由于Bx7OE位于小麦B组染色体上，而Dx5+Dy10位于小麦D组染色体上(图5)，因此Bx7OE和Dx5+Dy10不连锁，存在分离现象(图4)。

59个F3代材料的分子标记研究结果显示，在33个F3代材料中检测到了Bx7OE亚基(图1)，占检测群体的55.93%，在41个样本中检测到Dx5亚基(图2)，占总检测样本的69.49%，上述样品中有27份材料既存在Bx7OE亚基也存在Dx5亚基，占总测试样品的45.76%(图3)。结合59个与‘济麦22’农艺性状接近的受检材料，说明Bx7OE和Dx5+Dy10导入‘济麦22’的比例较高，但是STS分子标记为基因序列检测，只要序列存在即可检出，不能区分纯合子与杂合子，因此虽然导入比例加较高，但是并不能确定材料中Bx7OE和Dx5+Dy10亚基所在座位是否纯合。这27个材料可能存在大量的杂合子，需要后续进行分子标记跟踪及蛋白SDS-PAGE检测Bx7OE和 Dx5+Dy10的表达情况。

研究表明小麦籽粒红色为显性性状，白色为隐性性状[26]，在经过F2代农艺性状筛选的59个F3代株系中，仅9个纯系白色籽粒性状，说明‘津强1号’籽粒红色性状对‘济麦22’籽粒白色性状也显性，与其他品种的研究结果吻合。同时，研究表明部分品种籽粒红色性状受一对等位基因控制，F2呈现红白粒3∶1分离[26]，部分品种籽粒红色性状受二对等位基因控制，F2代呈现15∶1[26]，二者均呈现籽粒红色显著多于籽粒白色性状，F3代中白色籽粒将显著低于红色籽粒，因此F3代受检的59份样本中，白色籽粒显著少于红色籽粒，但是白色籽粒为纯合性状，后代不会出现分离现象。因此可以重点保留籽粒白色、含有Bx7OE+8、5+10亚基的材料。

农艺性状初步观察及染色体遗传特性分析发现，虽然‘津强1号/济麦22’后代筛选了农艺性状倾向于‘济麦22’的材料，但由于1/2的‘津强1号’染色体的渗入，导致后代不能完全保留‘济麦22’的优异性状， Bx7OE+8、5+10亚基所在基因座位位于两个同源群，因此应在F3代中筛选农艺性状偏向于‘济麦22’的材料与‘济麦22’进行回交，确保Bx7OE+8、5+10亚基导入后保持‘济麦22’的其他优异性状。