响应面法优化芋头莲藕复合醋酿造工艺的研究

王瑞璇，张莉*，周霞，殷兰兰，王政军

(1.青岛农业大学 海都学院，山东 莱阳 265200；2.青岛农业大学，山东 青岛 266109)

果醋是以水果为主要原料，通过现代生物技术酿造而成的一种营养丰富的酸性调味品或饮料[1-2]。目前果蔬醋类占食醋总产值的1/3[3]，其中含有丰富的醋酸、维生素、氨基酸等，集调味、营养和保健作用于一体[4-5]。近几年国内果醋产品虽日益增多，但市售仍以传统苹果醋等为主，蔬菜制成的新型果醋极少。

芋头作为一种不可或缺的蔬菜兼粮食作物，有着较高的营养和药用功效；其淀粉颗粒是马铃薯淀粉的1/10，消化率可达98%以上[6]。芋头块茎富含淀粉和多种对人体有益的矿物质及维生素；此外，芋头还含有降血糖和清除胆固醇作用的粘液蛋白，该蛋白被人体吸收后能产生免疫球蛋白，可提高人体的抵抗力。莲藕营养价值丰富，含有碳水化合物、多酚、氨基酸、卵磷脂、膳食纤维等[7]，在加快人体新陈代谢和改善人体皮肤状态方面的功效极其显著。目前，芋头莲藕复合醋的研发还是空白。本研究利用莱阳特产莱阳孤芋和莲藕榨汁发酵制醋，获得的芋头莲藕复合醋既可丰富果醋的种类，为工业化生产提供一定的参考，又为芋头和莲藕的深加工拓宽了渠道。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜芋头(莱阳孤芋)、莲藕：购于莱阳市农贸市场；安琪果酒专用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；α-淀粉酶、糖化酶：河南万邦实业有限公司；醋酸菌：成都市调味品研究所；壳聚糖：山东旭东生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MJ-25BM06A搅拌机 美的集团；水浴锅 龙口市先科仪器有限公司；糖度计 杭州恒仪仪表科技有限公司；酒精计 厦门雄发仪器仪表有限公司；YP1002N电子天平 上海天美天平仪器公司；恒温振荡培养器 天津市欧诺仪器仪表有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

芋头和莲藕预处理→榨汁→液化→糖化→冷却→过滤澄清→酒精发酵(接种酵母菌)→灭菌→过滤澄清→冷却→醋酸发酵(接种醋酸菌)→过滤澄清→灭菌→总酸测定→成品。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料预处理

将成熟、新鲜、无腐烂的芋头和莲藕分别洗净、去皮、切块并榨汁(料水比为3∶1)。

1.3.2.2 液化与糖化

在芋头莲藕混合汁中加入0.25% α-淀粉酶，在水浴锅中进行液化，温度为95 ℃，时间为30 min。将液化后的混合汁降温至65 ℃左右，加入0.3%的糖化酶，调节pH为5.3，于水浴锅中糖化60 min。

1.3.2.3 酒精发酵

将糖化完全的糖化醪液降温至30 ℃，用300目的滤布进行过滤，调整滤液的糖度，将每100 mL滤液装入250 mL的三角瓶内(装液量为40%)[8]，接入活化的果酒专用酵母，放入恒温振荡培养箱内，以28.5 ℃、120 r/min的转速进行酒精发酵3 d。

1.3.2.4 醋酸发酵

将酒精发酵后的发酵液在85 ℃的水浴中进行15 min灭菌处理[9]，然后冷却至室温，使用滤布(300目)过滤，调节发酵液的酒精含量、初始pH值、发酵温度，将醋酸菌接入，然后放进恒温振荡培养箱内，在30 ℃下以120 r/min的转速进行振荡培养，使醋酸菌发酵。

1.3.2.5 灭菌

该试验的灭菌步骤均为：放入立式压力蒸汽灭菌器，95 ℃，30 min，防止高温环境使其发生褐变。

1.3.2.6 澄清

利用1%的壳聚糖对发酵得到的醋液进行澄清，使用量占醋液总质量的0.5%，静置1.5 h[10-11]。

1.3.3 芋头莲藕汁最适配比的探索

在芋头汁∶莲藕汁分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 (V/V)的条件下，将混合汁灭菌后接入0.3%活化后的酵母，调整初始糖度为16%，在酒精度为8%的条件下进行酒精发酵3 d，再接种 7%的醋酸菌，醋酸发酵8 d，并通过感官评价指标确定芋头汁与莲藕汁的最佳配比[12]。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 初始糖度对芋头莲藕复合醋总酸的影响

在初始糖度分别为12%、14%、16%、18%、20%的条件下，将芋头莲藕混合汁酒精发酵3 d，之后接入7%的醋酸菌进行8 d的醋酸发酵，测定其总酸含量。

1.3.4.2 初始酒精度对芋头莲藕复合醋总酸的影响

以初始糖度为16%进行3 d的酒精发酵，调节初始酒精度分别为6%、7%、8%、9%、10%，接入7%醋酸菌进行8 d的醋酸发酵，测定其总酸含量。

1.3.4.3 醋酸菌接种量对芋头莲藕复合醋总酸的影响

以初始糖度为16%进行3 d的酒精发酵，调节酒精度为8%，分别接入3%、5%、7%、9%、11%的醋酸菌进行8 d的醋酸发酵，测定其总酸含量。

1.3.4.4 发酵时间对芋头莲藕复合醋总酸的影响

以初始糖度为16%进行3 d的酒精发酵，调节酒精度为8%，接入7%的醋酸菌，分别以2，4，6，8，10 d进行醋酸发酵，测定其总酸含量。

以上试验发酵阶段均采用恒温振荡培养箱(酒精发酵28.5 ℃、醋酸发酵30 ℃)，以120 r/min的转速进行发酵培养，在试验过程中测定总酸。

1.3.5 响应面试验设计

选择对芋头莲藕复合醋影响最大的醋酸菌接种量、初始酒精度、发酵时间为响应面分析的3个因素，响应值为总酸，进行三因素三水平的试验设计，因素和水平见表1。

表1 响应面分析因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.3.6 指标测定

糖度的测定：手持糖度计法；

酒精度的测定：酒精计法；

总酸测定：酸碱滴定法(以醋酸计，参照GB/T 12456-2008标准)；

芋头莲藕复合醋的感官质量：选择色泽、滋味和气味、组织状态、杂质4个方面进行感官评价。优质复合醋:颜色淡棕，醋香馥郁，酸味协调，无异味，透明澄清，无肉眼可见杂质。

2 结果与分析

2.1 芋头汁和莲藕汁最佳配比的确定

在酒精和醋酸的恒定发酵条件下，对不同比混合均匀的芋头汁和莲藕汁发酵得到的果醋进行感官评价，结果见表2。

表2 芋头汁和莲藕汁最适配比获得复合醋的感官评价Table 2 The sensory evaluation of compound vinegar at the optimal ratio of taro juice and lotus root juice

由表2可知，当芋头汁与莲藕汁的比例为1∶2(V/V)时，发酵得到的果醋为淡棕色，酸味柔和，香气浓郁协调，感官评价最优，为最佳配比。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 初始糖度对芋头莲藕复合醋总酸的影响

由图1可知，初始糖度对芋头莲藕复合醋的总酸产生有一定影响，在其他发酵条件不变的情况下，当初始糖度为12%～14%时，随着初始糖度升高，总酸含量呈现上升趋势；在初始糖度为16%时，复合醋的总酸达到最大值；当初始糖度为18%～20%时，总酸含量没有继续升高，反而呈现轻微下降趋势，但总体变化较小。这是由于过高的初始糖度抑制了酵母菌的生长，使得酒精积累下降，导致最终醋酸发酵产生的总酸含量不高。综上所述，最适初始糖度为16%。

图1 初始糖度对芋头莲藕复合醋总酸的影响Fig.1 Effect of initial sugar content on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.2.2 初始酒精度对芋头莲藕复合醋总酸的影响

由图2可知，初始酒精度是芋头莲藕复合醋总酸含量的重要影响因素[13]，随着初始酒精度的增大，最终获取的总酸也会增多，但是当酒精度为8%时，发酵得到的总酸含量最高。这是因为在相对较低的酒精度条件下，醋酸菌的代谢物质会相应地降低；如果酒精度相对比较高，会导致醋酸菌的活力受到较大的限制，进而使得总酸含量下降，初始酒精度应该控制在合理的范围内[14]，综上所述，最佳初始酒精度选择8%。

图2 初始酒精度对芋头莲藕复合醋总酸的影响Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.2.3 醋酸菌接种量对芋头莲藕复合醋总酸的影响

由图3可知，复合醋的总酸含量受醋酸菌接种量的影响较大，但醋酸菌接种量过大也可降低总酸的产量，对醋酸发酵起到相反作用。发酵液中总酸含量随着醋酸菌接种量的升高呈增大趋势，当接种量达到7%时，复合醋中的总酸含量达到最高。当接种量超过7%继续增加时，发酵得到的总酸反而减少。这可能是因为醋酸菌量较少时，在短时间内无法利用过多的乙醇；随着醋酸菌增多，该菌产生的有害代谢物逐渐增多，容易使细胞出现老化和发生自溶，导致得到的总酸量降低[15]。因此，选择7%为醋酸菌的最佳接种量。

图3 醋酸菌接种量对芋头莲藕复合醋总酸的影响Fig.3 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.2.4 发酵时间对芋头莲藕复合醋总酸的影响

由图4可知，发酵初期，复合醋的总酸含量增长较快，呈直线式上升；当发酵时间达到8 d时，复合醋的总酸量达到峰值，发酵天数继续增加，总酸量又稍微下降。这是因为在初期阶段，醋酸菌的数量比较少，随着发酵逐步深入进行，在醋酸菌数量达到一定的规模时，会导致其醋酸形成的速度逐步加快；当发酵进入到最后的阶段，醋酸菌能利用的乙醇量逐渐降低，从而产生的乙酸与乙酸挥发达到平衡状态，复合醋的总酸度达到顶峰。当发酵接近尾声时，乙酸挥发增加，进而造成总酸量的降低。因此，选择8 d为最适发酵时间。

图4 发酵时间对芋头莲藕复合醋总酸的影响Fig.4 Effect of fermentation time on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 响应面试验设计结果及分析

响应面试验设计方案及复合醋总酸含量见表3，回归方程的方差分析见表4。

表3 响应面试验方案及结果Table 3 Response surface test scheme and results

表4 响应面方差分析结果Table 4 Response surface variance analysis results

利用Design-Expert V8.0.6软件对表3中的数据进行多元回归拟合，得到总酸与各因素的二次多项回归方程模型为：总酸(g/L)=59.9+1.63A+2.04B+1.96C-1.15AB-1.30AC-1.11BC-3.26A2-3.44B2-4.29C2。

检验模型的显著性，由表4可知，模型的F值为73.83，P<0.0001，说明该模型因子具有显著性意义。F值越大，表明该因素对芋头莲藕复合醋总酸度的影响越显著，3个因素对总酸度的影响大小依次为：B发酵时间(d)>C初始酒精度(%)>A醋酸菌接种量(%)。

回归方程相关系数R2=0.9896，拟合度良好，表明试验数据可以较好地反映各因素和总酸度之间的关系。

2.3.2 各因素交互作用结果及分析

根据模型绘制而成的响应面图，坡度越陡，等高线越近似于椭圆，说明两者的交互作用越大，等高线密集程度也反映了此因素对总酸的影响程度。据此便可直观地看出各因素的交互作用对芋头莲藕复合醋总酸度的影响。

2.3.2.1 醋酸菌接种量和发酵时间因素间的交互作用

由图5可知，复合醋的总酸含量随着醋酸菌接种量的增大而增大，当接种量大于7%～8%时，总酸呈下降趋势。随着发酵时间的延长，总酸在增加，当发酵时间超过8～9 d时，总酸开始下降。由等高线的椭圆形可以看出，醋酸菌接种量和发酵时间两个因素之间的交互作用显著。

图5 醋酸菌接种量和发酵时间对芋头莲藕复合醋总酸度影响的曲面图与等高线Fig.5 The response surface and contour of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and fermentation time on the total acidity of taro and lotus root compound vinegar

2.3.2.2 醋酸菌接种量和初始酒精度因素间的交互作用

由图6可知，当醋酸菌接种量超过7%～8%、初始酒精度超过8%～8.5%时，复合醋总酸开始下降，且响应面坡度极为陡峭，说明醋酸菌接种量和初始酒精度对复合醋的总酸含量影响较大。等高线呈现椭圆形，表明醋酸菌接种量和初始酒精度两个因素之间的交互作用显著。

图6 醋酸菌接种量和初始酒精度对芋头莲藕复合醋总酸度影响的曲面图与等高线Fig.6 The response surface and contour of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and initial alcohol content on the total acidity of taro and lotus root compound vinegar

2.3.2.3 发酵时间和初始酒精度因素间的交互作用

由图7可知，发酵时间越长，复合醋的总酸含量越大，当发酵时间大于8～9 d时，总酸量开始下降。随着初始酒精度的升高，总酸亦升高，初始酒精度超过8%～8.5%时，总酸呈下降趋势。等高线呈现椭圆形，表明发酵时间和初始酒精度之间的交互作用显著。

图7 发酵时间和初始酒精度对芋头莲藕复合醋总酸度影响的曲面图与等高线Fig.7 The response surface and contour of the effect of fermentation time and initial alcohol content on the total acidity of taro and lotus root compound vinegar

2.3.3 响应面模型验证

通过二次回归方程，预测得到芋头莲藕复合醋的最优工艺条件为：醋酸菌接种量7.344%、发酵时间8.478 d、初始酒精度8.171%时，此条件下总酸为60.452 g/L。结合试验实际情况，选取醋酸菌接种量7.3%、发酵时间8.5 d、初始酒精度8.2%，进行3次试验，测定总酸为60.21 g/L，与预测值接近，说明该最佳工艺条件合理可行。

3 结论

本试验先进行单因素试验研究，再通过响应面法优化得到芋头莲藕复合醋的最优加工工艺:初始酒精度8.2%，醋酸菌接种量7.3%，30 ℃下发酵8.5 d，在此条件下得到的芋头莲藕复合醋的总酸为60.21 g/L，最终产品芋头莲藕复合醋呈淡棕色，醋味柔和且醋香浓郁协调，无异味，透明澄清，无悬浮物及沉淀物。