不同炮制方式的续断HPLC指纹图谱及化学计量学研究

潘 俊，李智敏，吴丽华，石 瑶，黄 慧，李晚谊，张 庭，王晓兵，肖 丹*

(1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650223；3.云南农业大学热带作物学院，云南 普洱 665099；4.贡山县茨开镇农业综合服务中心，云南 贡山 673500)

【研究意义】中药材的炮制是为了改变原材料的药性和降低毒性，提高中药在临床治疗中的效果和用药的安全性，炮制技术在不同程度上对中药材中有效成分有影响[1]。中药指纹图谱是现代中药质量控制和评价的基石和核心技术，因其具有特征性、专属性、可量化性、稳定性、有效性、完整性及细节处理的模糊性等特点，可以表达中药的整体特性，是一种合理的中药质量控制模式[2]。化学计量学(Chemometrics)是在化学测量过程中所使用的某种特定数学方法或统计学方法与数据交互关系的科学，能对整合后的色谱、光盘数据进行多元统计分析[3-5]。中药指纹图谱与化学计量学相结合，对中药材品质进行更全面、准确的评价。续断开始记载于《神龙本草经》，列为上品，传统为补阳药[6]。药用部位为植物川续断(DipsacusasperoidesWall.ex Henry)的干燥根；主治肝肾不足，腰膝酸软、风湿痹痛，跌扑损伤等病症[7]。续断化学成分主要有三萜皂苷类、生物碱类、挥发油类、环烯醚萜类、多糖类以及其它一些成分[8-11]。【前人研究进展】续断作为云南道地药材，运用指纹图谱与化学计量学相结合，对其炮制前后的质量评价研究较少。焦涛等利用HPLC-ELSD指纹图谱分析方法对续断炮制前后的内在成分进行研究，结果显示续断炮制前后化学成分有差异[12]。罗君等利用HPLC指纹图谱技术，对续断生品和酒炙品的化学成分进行分析研究，结果显示绿原酸及川续断皂苷Ⅵ的含量较炮制前有增加[13]。【本研究切入点】依据液相色谱的指纹特性，利用液相色谱法对11批不同产地的续断药材进行质量评价。【拟解决的关键问题】采用高效液相色谱法结合化学计量学对不同炮制方法的续断进行指纹图谱研究，旨在为续断质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

续断样品来源于不同省份药材市场采购获得，经云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定为川续断科川续断(DipsacusasperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai)的根茎，详细信息见表1。

表1 续断样品Table 1 The sample of Dipsacus asperoides

1.2 试剂

川续断皂苷Ⅵ购买于北京中科质检生物有限公司;乙腈(GR，美国 Sigma)；水(自制超纯水)；甲醇(AR，天津市风船化学试剂科技有限公司)。

1.3 仪器

LC20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)； DGG-9123AD电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；AX124ZH电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；BL10-250A超声波清洗机(上海比朗仪器有限公司)；UPT-I-20T纯水器(成都超纯科技有限公司)； HH-4数显恒温搅拌水浴锅(金坛区西域新仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，DS-5 μm，12 nm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，5 %B；5～12 min，15 %B；12～27 min，25 %B；27～42 min，30 %B；42～55 min，35 %B；55～60 min，35 %)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：212 nm；进样量：20 μl。

1.4.2 对照品溶液的制备 精密称取续断皂苷VI对照品2 mg，加甲醇配制成含续断皂苷VI 2 mg·mL-1的溶液，即得。

1.4.3 供试品溶液的制备 续断1号样品0.5 g，甲醇25 mL，置入具塞锥形瓶，摇匀，称重，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)30 min，冷却，称重，甲醇补足重量，过滤，取滤液5 mL，甲醇稀释10倍，过0.22 μm微孔滤膜即得。

1.4.4 供试品溶液测定 供试品溶液进样量为20 μl，按“1.4.1”项色谱条件进行检测，记录色谱图。

1.5 数据处理

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(中国药典委员会2004A 版)对数据进行相似度分析。采用SPASS 25.0软件对数据进行系统聚类、K-均值方法及主成分分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验 以续断样品S1号为对象，以“1.4.3”项方法处理样品， “1.4.1”项色谱条件测定色谱数据，重复进样6次，考察样品中共有峰的相对保留时间和峰面积。结果显示考察项前者的RSD为0.76 %，后者的RSD为4.15 %，表明仪器精密度良好。

2.1.2 重复性试验 以续断样品S1号为对象，以“1.4.3”项方法处理样品，重复称取0.5 g样品6份，依次进样，考察样品共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示考察项前者的RSD为0.81 %，后者的RSD为3.98 %，表明方法重复性良好。

2.1.3 稳定性试验 以续断样品S1号为对象，以1.4.3项方法处理样品，分别在24 h内每隔2 h进样分析，考察样品共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果考察项前者的RSD为0.57 %，后者的RSD为4.03 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2 HPLC指纹图谱建立

取15批续断样品，以1.4.3项下制备供试品溶液，按1.4.1项下的色谱条件进样，记录色谱数据。在实验条件一致的情况下，以色谱峰保留时间和紫外扫描图谱为比较参数，色谱图匹配得到23个共有峰，峰面积和保留时间见表2，色谱指纹图见图1。

表2 15批续断样品的共有峰保留时间及相对峰面积Table 2 Relative retention time and relative peak area of common peak for 20 batches of Dipsacus asperoides

2.3 共有峰面积及样品相似度计算

为避免图谱直观分析的主观性对分析结果的影响，将15批药材样品的HPLC图谱信号数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(中国药典委员会2004A 版)，图谱中由于15号峰分离度良好，峰位居中，峰面积较大，稳定性好，所有样品共有，因此设定15号为参比峰，色谱图进行自动匹配，中位数法生成对照图谱，时间窗宽度设为0.10 s，计算15批药材的相似度。相似度结果见表3。各样品色谱叠加图见图1。

表3 15批续断HPLC指纹图谱相似度评价Table 3 Similarity analysis of HPLC fingerprints of fifteen batches of Dipsacus asperoides

以续断药材共有模式为标准，进行整体相似性评价，15批续断样品的相似度分析结果见表3。指纹图谱分析结果表明，所测样品中有11 批续断药材指纹图谱中位数相关系数在 0.900～0.99，相似度较高，达到了相似度的基本要求，说明样品比较好。其中样品(S1、S2、S3、S6、S7、S9～S12，S15)质量差异较小，相似度均大于0.9。编号 S4、S5 、S8 、S13、S14 的药材指纹图谱相关系数小于0.90 (大于0.850 )，样品有一定的差别。

2.4 化学计量学分析

2.4.1 聚类分析 续断样品的色谱数据通过IBM SPSS 25.0软件进行分析，以峰面积作为变量，对11批续断药材进行聚类分析。结果显示，当分类距离d=5时，15批次续断样品聚为2类，编号为S1～S12的样品聚为第一类，为干燥、发汗处理的样品；编号为S13～S15的样品聚为第二类，是用酒、盐炮制的加工品(图2)。

2.4.2 主成分分析 将15批续断样品的23个共有峰峰面积用IBM SPSS 25.0统计分析软件中的因子分析进行主成分分析，以主成分特征值>1和方差贡献率>85 %作为选择主成分的依据。提取到6个主成分因子，其特征值>13.0，累积方差贡献率为86.99 %，即包括大部分信息，根据主成分分析得到所有样本的PCA二维投影图见图3，图中每一个点对应一个样本，共分为2类，与聚类分析结果一致。

3 讨 论

3.1 流动相的确定

通过对流动相的筛选比较，采用乙腈-水梯度洗脱能使峰集中在3～55 min内得到较多的色谱峰，实现色谱峰的分离度好、基线漂移小的实验要求。

3.2 指纹图谱相似度评价

通过对15批样品的指纹图谱数据的分析，发现样品HPLC指纹图谱有一定差异，但都拥有相同的色谱特征峰，经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》相似度计算显示，15个样品的相似性一般，编号 S4、S5、S8、S13、S14 的药材指纹图谱相关系数小于0.90(大于0.850)，与其他批次的续断样品相比，差异性大。说明产地和加工方法对续断药材的质量都有影响。

3.3 聚类分析与主成分分析评价

运用化学计量学中的聚类分析和主成分分析方法对15批续断样品的HPLC指纹图谱数据进行处理，续断样品得到了很好的聚类效果，主成分分析的二维得分图与聚类分析得到的结果一致，可以看出，干燥和发汗方法对续断中化学成分的影响小于酒制、盐制对续断药材的影响。续断皂苷Ⅵ的含量可以看出酒制和盐制对续断药材有效成分的含量有较大影响，发汗对续断药材有效成分的含量影响较小。

4 结 论

方法学考察结果显示，实验采用的色谱方法稳定、准确、重复性好，有效分离并获得较多的特征峰，此方法可行，简便快捷，为控制和评价炮制后续断药材的质量提供参考。本研究结论与樊媛洁[14]研究结果一致，炮制技术中增加辅料不仅使续断中皂苷类成分发生变化，对其他有效成分也具有一定影响，所含有效成分的种类和含量有差别。