酉州乌羊皮肤组织ASIP基因的RACE克隆及分析

付 琳，孙晓燕，任航行，李 杰，蒋 婧，王高富*

(1.重庆市畜牧科学院,重庆 荣昌 402460；2重庆市山羊工程技术研究中心,重庆 荣昌 402460)

【研究意义】肤色是一些哺乳动物(或品种)区分的标志之一[1]，可能与生产性能有直接的关系[2]，因此肤色在分子水平上成了动物的一个重要的育种性状，然而色素的表型具有高度多态性及不易于统计区分性，给其调控毛色的分子机制研究带来了困难[3]。【前人研究进展】ASIP(Agouti signaling protein，ASIP) 基因在哺乳动物的色素由真黑色素向棕黑色素转变过程中起着重要的作用，是研究动物群体或个体毛发、肤色表型差异的主要候选基因之一[4]，其突变对多种哺乳动物(小鼠、人、马、猪、牛、狗、猫、兔、兔、绵羊、山羊)毛色表型变化具有重要的影响[5-14]。ASIP基因包含多个等位基因位点，使动物皮肤与毛色呈现出广泛的表型。研究表明，ASIPmRNA在人、猪、绵羊、山羊、牛等哺乳动物的多个组织里广泛表达，推测在人和家畜中具有复杂且多样性的功能[15]，除了影响哺乳动物毛发与皮肤的色素沉积性状，ASIP基因同时可能也参与脂肪能量代谢、癌症等活动[16-17]。同时，对毛色与疾病的相关性研究，也可为诊断和治疗相关色素类疾病提供有益参考。在多种哺乳中已经获得了全部或者部分ASIP基因序列，山羊ASIP基因已定位于13q22[18]。【本研究切入点】对ASIP基因调控机制充分探索可为哺乳动物品种资源的保存与利用提供有益参考[19]。酉州乌羊是我国珍贵的地方特色遗传资源，是一种全身具乌皮表型的哺乳动物，不但具有良好的食、药兼用性[20]，也有望作为研究皮肤黑色素沉积的良好素材，发挥更多的作用。本研究采用RACE技术扩增酉州乌羊ASIP基因mRNA，通过预测分析其编码蛋白的理化性质和结构特点，初步揭示酉州乌羊ASIP基因的序列结构特征。【拟解决的关键问题】为ASIP基因影响酉州乌羊皮肤色素沉积的分子机制研究提供理论基础，也为后续深入开展ASIP基因对皮肤色素沉积与机体脂肪、能量代谢之间的互作机制探索提供理论参考。同时还对酉州乌羊肉质性状分子标记的开发具有潜在的应用价值，从而加快这一特色品种的选育进程，最终提高社会、生态与经济效益。

1 材料与方法

1.1 酉州乌羊ASIP基因RACE克隆

1.1.1 样品采集、RNA提取、纯化及反转录 在重庆市酉阳县酉州乌羊资源保护场采集9只酉州乌羊的皮肤组织，迅速装入做好标记的采样管中，立即投于液氮中带回实验室置于-80 ℃冰箱保存样品。按TaKaRaRNAiso Plus试剂盒说明提取总RNA，NANODROP 2000超微量分光光度计测定其浓度和纯度测定后，取3 μl待检测的RNA与l μl的上样缓冲液混匀，经1.0 %琼脂糖凝胶160 V，150 mA电泳12 min，在凝胶成像系统下观察检测结果，并进行拍照保存，将28S和18S条带的亮度和宽度比例均为 2∶1 的 RNA按SMARTer RACE 5′3′cDNA Amplification Kit说明书反转录，反转录产物保存于-20 ℃备用。

1.1.2 RACE引物设计 以山羊ASIP基因的mRNA序列(登录号NW_005100804)为模板，SMARTer RACE 5′3′ cDNA Synthesis Kit中10×Universal Primer A Mix (UPM)和Nested Universal Primer Short为上游引物(表1)，设计5′ RACE下游引物与3′ RACE 上游引物作为试验的引物(表1)。

表1 5′和3′ RACE引物Table 1 Primers for 5′ and 3′ RACE

1.1.3 RACE反应条件和克隆测序 按照SMARTer RACE 5′3′cDNA Amplification Kit说明书进行Outer RCR 和 Inner PCR，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，高亮的条带进行切胶回收。将Inner PCR产物通过TA克隆链接到pMD19-T载体上，过夜培养，挑取白色且形状圆润的单菌落至含有Amp+的LB液体培养基中，37 ℃摇床振荡过夜培养，菌液PCR鉴定重组子，阳性克隆送往上海生工生物技术公司测序。

1.2 蛋白质序列的生物信息学分析

以NCBI数据库中已发表的山羊序列为基础，使用DNAStar软件包对酉州乌羊ASIP基因序列进行编辑；使用Editseq软件查找开放阅读框，确定其CDS的范围；采用NCBI在线同源搜索工具BLAST，确定所获序列是否为目的基因序列；利用Mega 6.0进行多序列比对并构建进化树，分析酉州乌羊与其他物种ASIP的进化关系。酉州乌羊ASIP蛋白的理化性质的分析采用ExPASy在线工具(http://web.expasy.org/protparam/)，信号肽预测采用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，保守结构域分析采用NCBI在线工具CD-Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。二级结构用在线软件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)预测。三级结构利用在线同源建模SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/SWISSMODEL.html)进行预测。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取结果

按照RNAisoPlusRNA试剂的说明提取酉州乌羊皮肤组织样品总RNA，并用2 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。图1中3条清晰的条带从上到下依次为28S、18S和5S，且2S条带亮度是18S的2倍。经核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度后，总RNA的A260/A280的范围均在1.8～2.1，符合实验质量要求。

2.2 山羊ASIP mRNA序列克隆结果

OuterPCR的扩增产物均无特异带，整个电泳条带呈现弥散状，故将outerPCR产物稀释后进行InnerPCR。InnerPCR扩增产物中出现的条带分别切胶回收后连接至载体。经电泳检测，2个酉州乌羊样品5′RACE结果显示2种带型，其余样品为1种带型，所有3′RACE结果显示只有1种带型(图2)。

2.3 目的基因的鉴定

将测序结果使用BioEdit7.0软件比对拼接后，得到一段787 bp的序列，标为P1，包括209 bp的5′UTR区，402 bp的CDS区以及176 bp的3′UTR区，预测编码133个氨基酸(图3)，在编码区存在异义替换c.496G>T，其编码的氨基酸在第96位由谷氨酸转变为缬氨酸(p.Ala96Val)。在NCBI数据库中进行BLAST搜索比对，其与牛科物种ASIPmRNA序列相似度达96 %以上，与山羊的相似度高达99 %以上，证明该序列确为酉州乌羊的ASIPmRNA序列。与NCBI中山羊ASIPmRNA(NW_005100804)比对显示，P1无法与Exon1、Exon2匹配，在Exon3最末处缺失一个碱基G，与Exon4相似度为100 %，Exon5末端缺失5个碱基GAAAA。

5′RACE测序结果出现2条不同的序列，分别标为P2(341 bp)和P3(497 bp)。P2片段为所有酉州乌羊共有的转录本，P3片段只出现在1个酉州乌羊样品中。经BLAST比对，P2片段与牛科物种IIIA3基因相似度达94 %，P3片段与牛科物种TNNI2基因相似度达96 %(图4～5)。

2.4 物种间氨基酸序列相似性

采用在线工具Blastx对P1片段翻译得出其编码133个氨基酸，与NCBI中山羊ASIP(XP_017913224.1)氨基酸的相似性为99 %。采用基于遗传距离的邻近法对10个物种(酉州乌羊、山羊、绵羊、普通牛、水牛、骆驼、鹿、野猪、马、人类)的ASIP氨基酸序列进行聚类分析(图6)。山羊最先与分类学上同属羊亚科的绵羊聚为一类，接着与牛科动物聚为一类，然后与同是反刍动物的鹿聚成一类，再依次是骆驼、猪、马和人类，这一结果与动物进化规律较为一致。在第96位处氨基酸，其他物种为丙氨酸A，酉州乌羊表现为缬氨酸V(p.Ala96Val)，如红色方框位置所示(图7)。

2.5 酉州乌羊ASIP蛋白分析

2.5.1 酉州乌羊ASIP蛋白质理化性质预测 从表2可知，该蛋白质的分子式为 C635H1055N193O182S15，原子总数为2080，蛋白分子质量为14 786.45 Da，理论等电点为9.63，其氨基酸组成中，脯氨酸数量(Pro，P)最多，总数为14个，占10.5 %；亮氨酸(Leu，L)与赖氨酸(Lys，K)其次，总数均为13个，占9.8 %；谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、酪氨酸(Tyr，Y)数量最少，为1个，占0.8 %。总的带负电残基(Asp + Glu)为10，总的带正电残基(Arg+Lys)为25。在第10、11位氨基酸处具有疏水最大值2.978，在第31位氨基酸处最具有疏水小值-3.556，总平均亲水性为-0.401，不稳定系数为54.02，预测该蛋白为亲水性不稳定蛋白(图8)。SignalP 5.0预测其有一个22长度的信号肽，剪切部位在22～23氨基酸处。与山羊ASIP(XP_017913224.1 )相比，蛋白分子式、原子总数、蛋白分子量、平均亲水性、不稳定系数有一定差异。

表2 酉州乌羊ASIP理化性质预测Table 2 The prediction of YZD ASIP physical and chemical properties

2.5.2 酉州乌羊ASIP蛋白功能结构域预测 蛋白功能结构域预测结果显示，酉州乌羊ASIP蛋白在16～129位为Agouti信号蛋白家族保守结构域。Agouti结构域是富含半胱氨酸的C末端模块，其负责体外黑皮质素受体的结合活性(图8)。

2.5.3 酉州乌羊ASIP蛋白二级结构预测 从图9可知，其中构建α螺旋的氨基酸为42AA(31.58 %)，构建延伸链的氨基酸为15AA(11.28 %)，构建β转角的氨基酸为7AA(5.26 %)，无规则卷曲为69AA(51.88 %)。NCBI山羊ASIP(XP_017913224.1)的二级结构预测的相对应数据分别为α螺旋42AA(31.58 %)，延伸链7AA(5.26 %)，β转角3AA(2.26 %)，无规则卷曲81AA(60.90 %)，与之相比，酉州乌羊ASIP二级结构发生了改变。

2.5.4 酉州乌羊ASIP蛋白三级结构预测 使用在线工具SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)预测三级结构，如图10所示，酉州乌羊ASIP第96为缬氨酸(V)，而山羊ASIP第96位为丙氨酸(A)，三级结构预测显示在其96位氨基酸的氢键构成有差异，空间结构发生变化。

3 讨 论

3.1 ASIP基因的结构与功能

本试验采用5′与3′RACE较完整地扩增出了酉州乌羊ASIP基因(787 bp)序列，包括209 bp的5′ UTR区，402 bp的CDS区，以及176 bp的3′ UTR区。研究表明动物皮肤组织中ASIP基因非编码区的变异可能影响毛色的变化[21]，5′ UTR区序列的获得为以后深入研究山羊ASIP非翻译区的功能提供了基础。生物信息学预测酉州乌羊ASIP蛋白有一个长度为22个氨基酸的信号肽，切割位点位于22～23氨基酸处，在16～129位为Agouti信号蛋白家族保守结构域，与景炅婕等[22]对太行山羊的研究报道一致。ASIP蛋白可与α-MSH竞争性结合MC1R，调节真黑色素和褐黑色素生成的数量与比例，从而使动物表现出不同的毛色或肤色。该研究中发现的酉州乌羊ASIP基因编码区异义替换c.496 G>T，预测其导致编码的氨基酸由丙氨酸替换为缬氨酸(p.Ala96Val)，正位于Agouti信号蛋白家族保守结构域上，而该结构域是富含半胱氨酸的C末端模块，负责MC1R的结合活性，这一异义替换还造成了酉州乌羊ASIP二级结构域和空间构象的差异，结合蛋白质理化性质比较分析，推测其可能对ASIP蛋白的功能产生影响。

此外，5′ RACE结果中所有酉州乌羊个体中都出现了1条共有序列P2，其中1只出现了特有的序列P3，但无法与山羊ASIPmRNA序列匹配，P2与牛科物种IIIA3基因相似度达94 %，P3与牛科物种TNNI2基因相似度达96 %以上，这2个序列可能以融合基因的形式发挥作用，这一现象与酉州乌羊这一特色品种的基因组异常复杂有关，因此有待于获取酉州乌羊全基因组序列并进一步分析，从而进一步探索ASIP基因在山羊体内的调控途径。

3.2 ASIP基因的变异与山羊毛发、皮肤颜色的关系

国内外已有报道表明ASIP是影响绵羊与山羊毛色的一个重要候选基因。绵羊ASIP基因突变对各类毛色模式的分布有重要影响[23-24]。大量山羊ASIP位点的等位基因被报道，但ASIP等位基因与毛色、肤色相关研究所得结果与绵羊有差异[25-26]。Tang等[27]发现山羊ASIP基因外显子4的一个片段中的423G>T的颠转替换可能是与山羊黑色皮毛表型有关，并且ASIP基因第1内含子的T128缺失可能也在山羊毛色形成过程中发挥一定作用[21]。Henkel等[28]揭示了几种瑞士山羊品种ASIP等位基因不同的CNV，其导致了ASIP在山羊皮肤上黑色素区域和棕黑色素区域之间的不同表达。Fontanesi等[25]在6个山羊品种的ASIP基因的编码区鉴定出5个单核苷酸多态性(SNPs)，与山羊的毛色没有联系或没有完全联系。Badaoui等[29]在12个西班牙和意大利山羊品种中鉴定了两个错义突变和两个内含子SNPs，其中一个错义突变(Cys126Gly)可能通过破坏高度保守的二硫键引起结构变化，然而未观察到其与毛色有明显联系。Adefenwa等[30]在不同地区的6个山羊品种ASIP基因的包括部分外显子2和部分内含子2区域发现两个突变位点，均与山羊被毛颜色无明显的联系。张天等[31]研究发现ASIP基因表达量与山羊毛色无相关性，提示其在不同毛色山羊皮肤组织中可能存在不同调控机制。综上所述，不同山羊品种中ASIP基因对毛色影响的作用并不一致，ASIP基因编码区的变异不能完全解释山羊不同毛色的表型，关于ASIP对山羊毛色及肤色的影响机制仍未解析。上述研究同样显示了山羊皮毛颜色的遗传复杂性，除了受遗传因素的影响，还受环境因素的修饰。因此，需要对山羊ASIP基因启动子序列、整个编码区及非编码区进行全面的分析，并与其他调控毛色、肤色的候选基因进行关联分析，以确认表型的因果，及与其他基因的潜在的上位关系[32]，明确其对毛色的调控作用机制。关于本研究中酉州乌羊ASIP基因编码区的异义替换是否影响酉州乌羊的乌色皮肤表型，还有待于扩大种群数量、增加比较的品种种类，进一步试验验证。

4 结 论

获得酉州乌羊皮肤组织ASIP基因mRNA全序列(787 bp)，包括209 bp的5′ UTR区，402 bp的CDS区，以及176 bp的5′ UTR区，其编码133个氨基酸。酉州乌羊ASIP基因编码区发生异义替换c.496G>T，其编码的氨基酸由丙氨酸转变为缬氨酸(p.Ala96Val)，可能对酉州乌羊皮肤色素沉积性状产生影响。本研究为ASIP基因影响酉州乌羊皮肤色素沉积的分子机制研究提供了理论数据。