模拟酸雨及秸秆添加对农田土壤微生物呼吸及酶活性的影响

张旭，陈书涛，陈桂发，蔡敏，周丽，崔娜欣，邹国燕*

（1.上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海201403；2.上海低碳农业工程技术研究中心，上海201415；3.南京信息工程大学应用气象学院，南京210044）

酸雨已成为全球性环境问题之一[1]，其对陆地生态系统地下生态过程具有一系列潜在影响[2]。研究表明，酸雨可导致植物受损和土壤酸化，还会对农田生态系统碳循环会产生影响[3]。我国是农业大国，农业生产会产生大量的秸秆。我国每年产生约10.4亿t秸秆，占世界的1/7，其中有近1/5 的秸秆被露天焚烧[4]。秸秆焚烧产生大量的酸性气体（氮氧化物等），从而会加剧全球酸雨污染[5]。目前，秸秆还田是常见的农业管理措施，秸秆含有丰富的碳、氮、磷以及微量营养元素[6]，可作为能量和养分的载体；秸秆还田可以改变土壤生物化学过程[7-8]。

土壤呼吸是陆地生态系统中重要的碳循环过程[9]，其量值仅次于全球陆地总初级生产力（GPP）的估算值[10]。土壤呼吸主要分为自养呼吸（根系呼吸）与异养呼吸（微生物呼吸），其中土壤微生物呼吸指土壤有机碳和凋落物分解产生的CO2排放通量[11]，占土壤呼吸总量的52.1%[12]，是土壤中微生物生命活动的重要标志，并能够在一定程度上反映土壤有效养分、土壤通透性的优劣以及微生物活性和群落结构[13]。土壤酶是一种催化剂，是土壤生态系统中的重要组成部分，是评价土壤肥力、土壤微生物活性的重要指标[14]。土壤转化酶（Invertase）是一种水解酶，它能够将土壤中的大分子糖分解成葡萄糖和果糖，从而为土壤微生物提供养分；土壤过氧化氢酶（Catalase）是一种与土壤相关的还原酶，它通过催化过氧化氢分解从而将有毒物质快速转化为其他无害或毒性较小的物质[15]。研究土壤微生物呼吸、土壤转化酶和过氧化氢酶活性对于深入认识土壤碳氮循环具有重要意义。

国内外关于酸雨和秸秆还田对土壤碳氮循环过程的影响和对土壤微生物的影响已有大量研究：秸秆施用会提高土壤转化酶、过氧化氢酶活性以及土壤微生物呼吸速率[16-17]；酸雨H+浓度越高，其对酶活性的抑制作用越强[18]；酸雨会对农田土壤微生物呼吸产生影响，但其影响趋势并不确定（减少、增加或无影响）[19-20]。这些研究主要集中在单因素对土壤微生物呼吸及酶活性的影响，然而酸雨强度和秸秆还田量的交互作用对土壤微生物和酶活性影响如何？目前仍少见报道。本研究通过室内培养试验，设置不同强度的模拟酸雨pH 和秸秆添加量，研究模拟酸雨和秸秆添加对土壤酶活性和微生物呼吸的影响规律及其内在机制，以期为合理评估未来酸雨日益严重情况下农田土壤碳循环的变异过程和进行合理的秸秆还田提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤采自南京信息工程大学农业气象试验站（32.16°N，118.86°E），该站长期实行冬小麦（淮麦19 号）-大豆（八月白）轮作，土壤类型为黄棕壤（灰马肝土属），基本理化性状为：0～20 cm土壤pH为6.3，土壤有机碳和全氮含量分别为19.4 g·kg-1和1.15 g·kg-1，田间持水量为25.6%。该站年均温度为15.6 ℃，年降水量为1 100 mm，年降水pH 为4.92，年酸雨发生频率38%，酸雨类型为“硫-硝酸混合型”[21]。于2014年9月，用小铲子除去表土，取离地面0～20 cm处的土壤盛入清洁的牛皮纸袋中，随后置于阴凉处自然风干，用研钵磨碎后过2 mm筛，放入自封袋中密封保存备用。秸秆为该站种植的冬小麦——淮麦19 号，于2014 年6 月冬小麦收获后将秸秆晾干，粉碎成0.5～1.0 cm并混合均匀，放入自封袋中密封保存备用。

1.2 培养试验

模拟酸雨强度的选择参照以往的研究[22-24]，即模拟酸雨强度一般设置在pH 4.0～2.0之间。设置4个模拟酸雨强度，用n（H2SO4）和n（HNO3）按4.5∶1 配制pH 1.0 的酸雨母液[25]，再将适量去离子水和酸雨母液混合配制成pH 为pH=6.7（去离子水CK）、pH=4.0（A1）、pH=3.0（A2）、pH=2.0（A3）的模拟酸雨供试液。每个模拟酸雨pH 下设置4 个秸秆添加量（0、0.6、1.2、1.8 g），共16 个处理，即去离子水+秸秆（CK-0、CK-0.6、CK-1.2、CK-1.8）、pH 4.0+秸秆（A1-0、A1-0.6、A1-1.2、A1-1.8）、pH 3.0+秸秆（A2-0、A2-0.6、A2-1.2、A2-1.8）、pH 2.0+秸秆（A3-0、A3-0.6、A3-1.2、A3-1.8）。每个处理设置3个重复。

分别向489 mL 广口培养瓶中放入60 g 干土，加去离子水10.6 mL，调节土壤的含水量为15%。在培养试验开始前，预先对土壤进行7 d预培养，为抵消水分蒸发的影响，于每日下午16：00 采用称取质量的方法滴加去离子水调节土壤含水量。随后，将秸秆按添加量均匀覆盖于土壤表面并进行一次模拟降雨，降雨量为10 mL，于20 ℃的培养箱进行密封培养。培养期间于每日下午16：00 采用称取质量的方法分别用对应的模拟酸雨调节土壤含水量，以保持含水量不变。滴加时，使用移液管缓慢滴加，以避免因滴加水对土壤微生物呼吸产生短期内的激发效应。

1.3 土壤微生物呼吸速率的测定

秸秆中大部分物质经过30 d 的培养会完全分解[26]，因此该试验培养天数设置为31 d。于试验开始的第1、2、3、5、7、10、14、20、27、31 d 的上午9：00 使用SoilBox-FMS（土壤CO2排放量测量系统，Miller 公司，美国）测定土壤CO2排放速率，共测定10次。

1.4 土壤pH、转化酶及过氧化氢酶的测定

培养试验结束后，采用pH 计（Starter 2100，Sarto⁃rius 公司，德国）测定土壤pH（水土比为2.5∶1）；采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定土壤转化酶活性[27]；采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性[28]。

1.5 数据分析

使用加权累积法估算各处理累积土壤微生物呼吸量（31 d 土壤微生物呼吸总量）。原始数据使用Excel 2019 进行初步整理和绘制图表，使用SPSS 25软件进行统计分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨及秸秆添加对土壤pH的影响

在相同秸秆添加量、不同模拟酸雨pH作用下，培养试验结束后的土壤pH 随模拟酸雨pH 的降低而降低；在相同模拟酸雨pH、不同秸秆添加量作用下，各处理对外源酸的缓冲能力存在差异（图1）。

供试土壤初始pH 为6.3，CK-0 处理在去离子水作用下土壤pH略微上升。与CK-0相比，A1-0、A2-0和A3-0 处理土壤pH 分别下降0.27、0.33、0.34 个单位，CK-0.6、CK-1.2、CK-1.8 土壤pH 分别下降0.23、0.35、0.21 个单位；在模拟酸雨和秸秆添加复合作用下，土壤pH 介于5.69～5.92 之间。以上结果表明，模拟酸雨和秸秆添加均会降低土壤pH，并且两种因素复合处理比单一处理的土壤pH降幅更大。

2.2 土壤微生物呼吸的时间变异性

在不同秸秆添加量和模拟酸雨pH 条件下，各处理累积土壤微生物呼吸量均随着培养时间的延长而逐渐升高，但增加速率逐渐降低，表明试验前期土壤微生物呼吸速率高于后期（图2）。在相同秸秆添加量下，累积土壤微生物呼吸量随着模拟酸雨pH 的减小而减小，不同观测日期的累计土壤微生物呼吸量差异达到极显著水平（P<0.001）。在相同模拟酸雨pH下，不同秸秆添加量处理的累积土壤微生物呼吸量存在极显著差异（P<0.001），CK-1.8 处理的累积土壤微生物呼吸量最大，A3-0 处理的累积土壤微生物呼吸量最小。

2.3 土壤微生物呼吸与模拟酸雨pH 及秸秆添加量的关系

模拟酸雨pH与31 d的累积土壤微生物呼吸的关系可用一元线性方程描述（图3），其P 值均达到显著水平（P<0.05）。0、0.6、1.2、1.8 g秸秆添加量下累积土壤微生物呼吸量分别为0.063～0.204、0.092～0.232、0.108～0.206、0.127～0.301 mg·g-1。1.8 g 秸秆添加量下的模拟酸雨pH与土壤微生物呼吸的线性回归方程斜率最大，表明在1.8 g 秸秆添加量条件下土壤微生物呼吸对模拟酸雨pH变异的响应程度最大。

秸秆添加量与31 d 的累积土壤微生物呼吸的关系也可用一元线性方程描述（图4），其P 值均达到显著水平（P<0.05）。CK、A1、A2 和A3 条件下累积土壤微生物呼吸量分别为0.204～0.301、0.113～0.186、0.074～0.151、0.063～0.127 mg·g-1。CK-1.8 处理的土壤微生物呼吸量最高，CK-0 处理的土壤微生物呼吸量高于A1-1.8、A2-1.8 和A3-1.8 这3 个处理，表明在模拟酸雨和秸秆添加复合影响下，模拟酸雨对土壤微生物呼吸的抑制作用大于秸秆添加对土壤微生物呼吸的促进作用，即模拟酸雨和秸秆添加交互作用表现为抑制土壤微生物呼吸。

由于模拟酸雨pH和秸秆添加量对土壤微生物呼吸均有显著影响，故以模拟酸雨pH（x1）及秸秆添加量（x2）作为两个变量分析其对土壤微生物呼吸（y）的复合影响，结果表明，y与x1和x2的关系可用如下方程描述：

y=0.033x1+0.043x2- 0.018（R2=0.985，P<0.001）

相比基于模拟酸雨pH和秸秆添加量的单因素拟合方程，该方程对土壤微生物呼吸同样具有较高的解释性（98.5%）。

双因素方差分析结果表明（表1），不同模拟酸雨pH（F=26.544，P<0.001）和秸秆添加量（F=111.069，P<0.001）处理下土壤微生物呼吸均具有极显著差异，但两者的交互作用对土壤微生物呼吸无显著影响（F=0.457，P=0.892）。

2.4 土壤转化酶和过氧化氢酶活性

由表2 可见，A1-0、A2-0、A3-0 这3 个处理转化酶活性分别比CK-0 显著（P<0.05）提高了23.09%、124.09%、100.33%，A2强度的酸雨对转化酶活性的促进作用最强。秸秆添加量与转化酶活性呈显著正相关（P<0.05），CK-0.6、CK-1.2、CK-1.8这3个处理转化酶活性分别比CK-0 提高了75.08%、228.41%、366.78%。总体来看，模拟酸雨、秸秆添加、模拟酸雨及秸秆添加处理较对照提高了土壤转化酶活性，对转化酶活性均表现出促进作用。

与CK-0 处理过氧化氢酶活性相比，A2-0、A3-0两个处理分别显著（P<0.05）降低了3.1%、4.4%，而A1-0 处理无显著影响；CK-0.6、CK-1.2、CK-1.8 这3个处理分别提高了2.12%、5.78%、10.38%，秸秆添加量与过氧化氢酶活性呈显著正相关（P<0.05）。总体来看，短期高强度模拟酸雨（A1、A2）显著抑制土壤过氧化氢酶活性，低强度模拟酸雨（A3）无显著影响；秸秆添加、模拟酸雨及秸秆添加较对照提高了过氧化氢酶活性，对过氧化氢酶活性均表现出促进作用。

2.5 土壤微生物呼吸与土壤酶活性的关系

相同模拟酸雨pH 条件下，各处理31 d 的累积土壤微生物呼吸与转化酶活性之间的关系均可用一元线性方程描述，但土壤微生物呼吸对转化酶活性增加的响应程度存在差异（图5）。CK和A2条件下转化酶活性与土壤微生物呼吸存在显著相关关系（P<0.05）。对于所有模拟酸雨处理，土壤微生物呼吸与转化酶活性之间的关系也可用一元线性方程描述，其P值达到显著水平（P<0.05）（图6）。

相同模拟酸雨pH 条件下，31 d 的累积土壤微生物呼吸与过氧化氢酶活性均可用一元线性方程描述（图7），其P 值均达到显著水平（P<0.05）。对于所有模拟酸雨处理，土壤微生物呼吸与过氧化氢酶活性之间的关系也可用一元线性方程描述，其P值达到极显著水平（P<0.001）（图8）。

表1 模拟酸雨pH、秸秆添加量对土壤微生物呼吸影响的双因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA for analyzing the effects of the pH of SAR and amended straw on SMR

表2 不同处理的土壤酶活性（mL·g-1）Table 2 Soil enzyme activities under different treatments（mL·g-1）

总体来看，土壤转化酶和过氧化氢酶活性是反映土壤微生物呼吸量大小的良好指标。

由于土壤转化酶、过氧化氢酶对土壤微生物呼吸均有显著影响，故而以转化酶活性（x1）、过氧化氢酶活性（x2）作为两个变量分析其对土壤微生物呼吸（y）的复合影响，结果表明，y与x1和x2的关系可用如下方程描述：

y=-0.001x1+0.98x2- 0.712（R2=0.955，P<0.001）

相比基于土壤转化酶或过氧化氢酶活性的单因素拟合方程，该方程对土壤微生物呼吸具有更高的解释量（95.5%）。

3 讨论

3.1 模拟酸雨、秸秆添加对土壤微生物呼吸的影响

土壤微生物是土壤生态系统的核心，其种类、数量和活性会影响土壤微生物呼吸量，也与土壤中可利用的碳氮等营养元素含量有关[17]。以往研究表明，酸雨对土壤微生物的影响主要以负面为主[2，29-30]。一方面，酸雨会加速土壤酸化，导致土壤环境恶化，降低土壤微生物量；另一方面，酸雨会改变土壤微生物群落结构，使土壤微生物活性降低，从而抑制土壤微生物呼吸[29]。刘义凡[30]研究发现，土壤微生物呼吸会随着酸雨H+浓度的增大而降低。秸秆还田不仅可以增加土壤有机质含量，提高土壤生物学肥力[31]，还可以显著增加土壤微生物的数量[32]。张庆忠等[33]研究发现，秸秆还田可促进土壤呼吸速率。总之，模拟酸雨和秸秆添加会通过影响土壤微生物过程来影响土壤微生物的呼吸作用。

在本研究中，模拟酸雨显著抑制了土壤微生物呼吸，而秸秆添加显著促进了土壤微生物呼吸。总体来看，模拟酸雨pH 和秸秆添加双因子处理对土壤微生物呼吸的影响表现为各自效应的复合，但这两个因子复合后并未对土壤微生物呼吸产生显著影响。这可能是由于秸秆添加的促进作用和模拟酸雨的抑制作用相互抵消所致。故在今后的研究中，我们有必要深入研究两因子复合对土壤微生物呼吸的影响机制。

3.2 模拟酸雨、秸秆添加对酶活性的影响

土壤酶活性通常被认为是土壤微生物活性和功能的指标[34]。酸雨会影响土壤微生物数量以及土壤对各种胁迫的敏感性[35]。此外，模拟酸雨会降低土壤pH，土壤pH 会改变酶与土壤中腐蚀质或黏土间的吸附行为，影响酶的解离状态，从而改变土壤中酶的活性[36]。何伟静等[37]研究发现，土壤转化酶和过氧化氢酶活性随着酸雨H+浓度的增大而降低，表现出抑制作用。而韩玮等[38]研究发现，模拟酸雨对土壤转化酶和过氧化氢酶活性表现为先激活后抑制效应。而王俊龙等[39]研究发现，酸雨在短时间内对土壤转化酶和过氧化氢酶表现为抑制作用，之后逐渐转化为促进作用。在本研究中，土壤pH随模拟酸雨pH的降低而降低，与Kang 等[36]的研究结果一致；模拟酸雨对土壤转化酶活性表现为促进作用，高强度模拟酸雨对过氧化氢酶活性表现为抑制作用。酸雨对土壤酶的影响比较复杂，出现研究结果不一致的原因可能是酸雨对土壤酶活性的影响与土壤类型、酸雨H+浓度以及成分有关，短期的模拟酸雨处理并不一定会实质性地改变土壤pH，而是改变了土壤碳、氮等营养元素的有效性，这可能对土壤酶产生激活、抑制或无影响[40]。

秸秆添加可以提高土壤转化酶和过氧化氢酶活性[17，41-42]。如：陈书涛等[41]研究发现，小麦秸秆施用显著提高了土壤转化酶和过氧化氢酶活性，徐国伟等[42]也得到了类似的结论。胡乃娟等[43]研究发现，25%小麦秸秆还田量可以显著提高土壤转化酶和过氧化氢酶活性。而韩新忠等[44]的研究结果表明，25%和50%小麦秸秆还田量显著提高了土壤转化酶和过氧化氢酶活性，75%秸秆还田量显著提高了土壤过氧化氢酶活性。与以往的研究类似，本研究结果也表明，土壤转化酶和过氧化氢酶活性与秸秆添加量呈显著正相关，其活性随着秸秆添加量的增大而增大。一方面，施入土壤中的秸秆腐解后，会增加土壤养分含量，为土壤中的微生物提供充分的养分[31]；另一方面，秸秆还田能够增加土壤中微生物的代谢速度，加快营养元素和有机质的循环转化，从而提高土壤养分的生物有效性[8]，这一系列反应直接或间接地提高了土壤酶活性。

3.3 土壤酶活性与土壤微生物呼吸的关系

土壤中各类酶活性的大小可以决定生物化学反应速率[45]，生物化学反应速率又影响着土壤微生物呼吸的强弱。土壤酶活性和土壤微生物呼吸显著的线性回归关系很好地体现了土壤中各生物学过程的内在联系（图6和图8）。以往的研究也验证了土壤酶活性和土壤微生物呼吸的相关性[34，46-47]。例如，Lü 等[34]研究发现，土壤酶活性对不同酸雨类型或强度的响应与土壤微生物数量对酸雨的响应相似。Cox等[46]研究发现，土壤酶活性的增强可以促进土壤微生物呼吸作用；万忠梅等[47]研究发现，湿地的土壤微生物呼吸与土壤转化酶、过氧化氢酶活性存在显著正相关关系。本研究结果与万忠梅等[47]的研究结果一致，即土壤微生物呼吸与转化酶、过氧化氢酶活性的变化具有一致性，他们之间存在显著正相关关系。土壤微生物呼吸为酶促反应，不同类型土壤的酶活性与土壤微生物呼吸的相关性存在差异[48]。关于不同环境、不同条件下土壤酶活性与土壤微生物呼吸的关系有待进一步研究。

4 结论

（1）土壤微生物呼吸与模拟酸雨pH 和秸秆添加量之间的关系均可用线性方程描述，秸秆添加显著促进了土壤微生物呼吸，模拟酸雨pH 显著抑制了土壤微生物呼吸，而两者的交互作用对土壤微生物呼吸无显著影响。

（2）在无秸秆添加条件下，与去离子水处理相比，pH4.0、pH3.0、pH2.0 模拟酸雨处理使得转化酶活性分别显著提高了23.09%、124.09%、100.33%；pH 3.0、pH 2.0 处理使得过氧化氢酶活性显著降低了3.1%、4.4%，pH 4.0 处理无影响。在去离子水条件下，与未添加秸秆相比，0.6、1.2、1.8 g 秸秆添加量使得转化酶活性分别显著提高了75.08%、228.41%、366.78%，使得过氧化氢酶活性分别显著提高了2.12%、5.78%、10.38%。

（3）对于所有模拟酸雨处理，土壤微生物呼吸与过氧化氢酶活性之间存在极显著的线性回归关系，与转化酶活性之间存在显著的线性回归关系，过氧化氢酶和转化酶活性双因素拟合方程对土壤微生物呼吸具有更高的解释量。

（4）土壤微生物呼吸与土壤酶活性有关，转化酶和过氧化氢酶活性可在一定程度上解释不同处理下土壤微生物呼吸的变异。