四氢嘧啶对酪氨酸酶的抑制作用机制及类型※

张 芳，张 鑫，杨海山，王志博，汪明香，沈国平，王 嵘，朱德锐

(青海大学医学院，基础医学研究中心，青海 西宁 810001)

有学者认为[1]，美白剂是通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成继而达到祛斑美白效果，但美白剂对酪氨酸酶的抑制作用机理及类型不明。本研究拟对四氢嘧啶(Ectoine)对酪氨酸酶的抑制作用机制及类型开展研究。

1.材料与方法

1.1 主要材料和试剂

Ectoine(纯度≥95%)购自德国Fluka Analytical公司；维生素C乙基醚(VC乙基醚)购自山东优索化工公司；海藻糖与熊果苷购自河北千汇生物公司；烟酰胺购自北京Solarbio科技公司；L-酪氨酸和酪氨酸酶(活力2.5*103U)购自合肥博美生物科技有限公司。JB/T-5374-1991型电子天平(精确率0.1mg)购自德国梅特勒-托利多公司；501型超级恒温水浴箱购自常州国华电器公司；Mili-Q Integral型纯水仪购自法国默克化工公司；754型紫外可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司。

1.2 研究方案

酪氨酸酶(Tyrosinase)是体内黑色素生物合成的关键靶点[2]。抑制剂通过抑制酪氨酸酶活力使黑色素颗粒生成减少从而达到美白功效。据此设计研究方案如下：用分光光度法测定不同质量分数的Ectoine及与美白剂复配时对酪氨酸酶活力的抑制率；之后固定L-酪氨酸浓度，加入不同活力的酪氨酸酶，测定不同质量分数Ectoine对酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化活力的影响，判断反应类型；再固定酪氨酸酶活力，改变L-酪氨酸浓度，考察不同质量分数Ectoine对酶活力的影响，以 Lineweaver-Burk双倒数作图法判断Ectoine的抑制类型。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制

磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)的配置：精密称取Na2HPO43.55 g、NaH2PO43.90 g，混合后用去离子水溶解定容至100 mL，调节pH约6.8左右。1.0 mmol/L酪氨酸溶液的配制：精密称取L-酪氨酸0.18 g，加入5 mL盐酸(0.1mol/L)溶解后，加约95 mL PBS缓冲液，调节pH约6.8左右，后定容至100 mL。酪氨酸酶溶液的配置：将酪氨酸酶(酶活力：2.5×103U)溶于250 mL PBS缓冲液中，制成酶活力为100 U/mL的酪氨酸酶溶液。上述配制溶液置4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 酪氨酸酶抑制率测定

酪氨酸酶抑制率测定参照文献[3]方法，反应液组成与配比见表1。将L-酪氨酸溶液、PBS缓冲液和测试液依次加入A1、A2、A3和A4试管中，充分混匀，置37 ℃恒温水浴箱加热5 min。再将酪氨酸酶溶液依次加入到A1、B1试管中混匀，反应15 min，测定各组吸光值(475 nm)并计算抑制率(I%)。I%=[1-(B1-B2)/(A1-A2)]，式中A1、A2、B1和B2为各组的吸光度值。

1.3.3 Ectoine对酪氨酸酶的抑制率测定

配制不同浓度的Ectoine水溶液，质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，参照1.3.2方法测定酪氨酸酶抑制率。

1.3.4 Ectoine与美白剂复配时对酪氨酸酶的抑制率测定

选取0.5%熊果苷、2.0%烟酰胺和2.0%VC乙基醚[4]与不同质量分数的Ectoine进行复配，参照1.3.2方法测定酪氨酸酶抑制率。

1.3.5 对酪氨酸酶活性的抑制性质分析

在同一底物酪氨酸质量浓度下，测定不同质量浓度的Ectoine对酪氨酸酶活性的抑制作用。固定底物L-酪氨酸浓度(1.0mmo/L)，改变酶含量(40、60、80和100U/mL)和Ectoine质量分数(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，测定吸光值A475。以酪氨酸酶的活性作为横坐标，A475作为纵坐标，分析不同质量分数下Ectoine对酪氨酸酶活性的抑制关系。

1.3.6 对酪氨酸酶活性的抑制动力学分析

为确定Ectoine的抑制类型，对Ectoine进行动力学实验，利用Lineweaver-Burk双倒数作图得动力学曲线，探讨抑制剂对酶促反应的抑制类型[5]。固定酪氨酸酶含量(100U/mL)，改变底物L-酪氨酸质量浓度(0.25、0.5和0.75和1.0mmol/L)和Ectoine质量分数(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，测定吸光度值A475。以底物L-酪氨酸浓度的倒数值为横坐标，以A475的倒数值为纵坐标，确定Ectoine的抑制类型。

1.4 统计学方法

2.结果

2.1 Ectoine对酪氨酸酶的抑制率

不同浓度的Ectoine(质量分数%，w/v)对酪氨酸酶的活性抑制率见图1和表2。图1和表2显示，酪氨酸酶的活性抑制率随Ectoine的浓度升高而抑制效果增加，当Ectoine浓度为2.0%时，其平均抑制率为36.33%。当Ectoine浓度大于2.0%时，抑制率升高趋势平缓，计算可知半抑制浓度(IC50)为4.58 g/L。由此表明Ectoine能够抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生物合成，具备潜在的美白效果。

表2 不同质量分数的Ectoine对酪氨酸酶的抑制率

图1 Ectoine对酪氨酸酶的抑制率

2.2 复配使用Ectoine与美白剂对酪氨酸酶的抑制率

不同浓度(质量分数)的Ectoine分别与3种美白剂(脱氧熊果苷、烟酰胺和VC乙基醚)进行复配，测得的酪氨酸酶活性抑制率见表3。表3显示，脱氧熊果苷与Ectoine复配时，7个浓度梯度间的酪氨酸酶抑制率均无统计学差异(P>0.05)，表明Ectoine不能促进熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率。当Ectoine与烟酰胺复配时，7个浓度梯度间的酪氨酸酶抑制率均明显上升(P<0.01)，表明Ectoine与烟酰胺复配对酪氨酸酶的抑制作用具有协同促进效果。Ectoine与VC乙基醚复配时，7个浓度梯度间的酪氨酸酶抑制率均明显上升(P<0.01)，表明Ectoine与VC乙基醚复配时，对酪氨酸酶的抑制作用具有协同促进效果。此外，Ectoine对烟酰胺的促进作用总体上优于VC乙基醚，且在质量分数为2.5%时，抑制率约为66.17%，抑制效果最佳。

表3 不同质量分数的Ectoine与三种美白剂复配时对酪氨酸酶的抑制率

2.3 Ectoine对酪氨酸酶的抑制性质分析

由2.1结果可知，当Ectoine浓度大于2.0%时，抑制率升高趋势平缓，故选取2.0%(含2.0%)的4个质量分数(2.0%、3.0%、4.0%和5%)进行动力学实验。固定底物L-酪氨酸酶浓度为1.0 mmol/L，改变酶含量(40、60、80和100U/mL)和Ectoine质量分数(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，测定吸光值A475，结果见图 5。图 5显示，在相同酶活力下，随着Ectoine质量分数的增高，A475吸光值逐渐变小，直线的斜率下降，说明Ectoine对酪氨酸酶的作用属于可逆抑制。

图2 不同质量分数的Ectoine对酪氨酸酶的抑制作用关系图

2.4 Ectoine对酪氨酸酶的活性动力学分析

由2.3结果可知，Ectoine对酪氨酸酶活性的抑制属于可逆抑制。可逆抑制分为竞争型、非竞争型、反竞争性型和线性混合型。固定底物酪氨酸酶含量(100U/mL)，改变L-酪氨酸酶浓度(0.25、0.5、0.75和1.0mmol/L)和Ectoine质量分数(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，测定吸光值A475，通过Lineweaver-Burk 取双倒数图判断抑制类型，结果如图3所示。图3显示，Ectoine质量分数为2.0%、3.0%、4.0%和5.0%时的线性方程分别为y=2.827x+10.67(R2=0.989)、y=3.212x+11.79(R2=0.990)、y=3.654x+13.49(R2=0.989)、y=4.105x+15.05(R2=0.995)，其中Lineweaver-Burk双倒数作图相交于横轴的一点，A475吸光值随着Ectoine的质量分数增加而变小，抑制常数(Km=0.41g/L)不变，反应速度随Ectoine质量分数增加而减小，符合非竞争性抑制类型的特征。

图3 Ectoine抑制酪氨酸酶动力学曲线图

3.讨论

美白剂对酪氨酸酶的抑制作用机理各有不同，严航等[6]发现薏苡仁提取液对酪氨酸酶有一定抑制作用，IC50为1.4 mg/mL，抑制类型为可逆线性混合型；孙劲毅等[7]发现茶皂素对酪氨酸酶有一定抑制作用，IC50为48 g/L，抑制类型为可逆竞争性抑制；刘琦等[4]发现熊果苷、烟酰胺以及VC乙基醚对酪氨酸酶活性均具有抑制效果，抑制类型为可逆非竞争性抑制型。本研究结果显示，Ectoine对酪氨酸酶具有一定抑制作用，IC50为4.58 g/L；Ectoine与VC乙基醚或烟酰胺复配时，酪氨酸酶的抑制效果明显提高，尤以2.5% Ectoine最佳，抑制率分别为75.03%和66.17%；而Ectoine与脱氧熊果苷复配时对酪氨酸酶的抑制作用无明显提高。另外，实验通过分别固定L-酪氨酸浓度和酶含量，测定不同质量分数的Ectoine对酪氨酸酶抑制的影响，判断其对酪氨酸酶活性的抑制作用类型和作用机制，结果表明Ectoine对酪氨酸酶的抑制类型和作用机制为可逆抑制中的非竞争性抑制，Km为0.41 g/L。故由结果可推断Ectoine对酪氨酸酶的抑制作用是通过降低酶的活力，与酪氨酸酶分子上的独立部位结合，而不与底物L-酪氨酸竞争活性中心。

综上所述，Ectoine对酪氨酸酶有一定的抑制作用，与VC乙基醚、烟酰胺分别复配对酪氨酸酶的抑制作用具有协同效果，其作用机制及类型为可逆抑制中的非竞争性抑制。