外周血来源外泌体中miR-21水平与2型糖尿病患者胰岛素抵抗的相关性

陈建军，王悦，王玉梅

胰岛素抵抗是2型糖尿病（T2DM）发病的主要原因，患者血糖控制不佳常导致脂质代谢异常、血糖代谢紊乱、高血压及动脉硬化的发生。有研究发现miR-21与多种炎症疾病相关，可能通过炎症途径介导胰岛素抵抗的发生[1]；也有研究报道T2DM患者外周血来源外泌体中miR-21表达水平明显升高[2]，但与发生胰岛素抵抗的关系尚不明确。本研究探讨T2DM患者外周血来源外泌体中miR-21表达水平与胰岛素抵抗的关系，旨在为T2DM的治疗提供新的思路。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017年7月至2019年7月浙江省安吉县中医医院就诊的43例T2DM患者为研究组，均符合2010年美国糖尿病协会（ADA）糖尿病诊疗指南中的诊断标准[3]。其中男28例，女15例；年龄44～74岁，平均（52.1±6.3）岁；病程1～8年，平均（4.16±1.14）年。另选取同期健康体检者43例为对照组，男29例，女14例；年龄45～74岁，平均（49.3±6.1）岁。本研究纳入对象均签署知情同意书，并经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 代谢指标检测收集研究对象的体质量、身高及体质量指数（BMI）等资料，禁食12 h，清晨采血检测空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）=FPG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测患者血清中炎症因子IL-6及IL-1水平。

1.2.2 外泌体的提取及鉴定无菌收集研究组及对照组外周血10 ml，3 000 r/min离心10min后，12000×g离心10min收集上清，以1∶5的比例加人ExoQuickTM试剂（美国SBI公司）混匀后静置于4℃过夜。次日1 500×g离心30 min，弃上清，使用4℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬底部沉淀，BCA蛋白定量后储存于－80℃备用。使用醋酸双氧铀对外泌体进行染色，冷冻电镜鉴定外泌体形态；使用Western-blot法检测提取物中CD63、TSG101及Calnexin表达情况，所用抗体均购自美国Abcam公司，稀释比例为1∶1 000。

1.2.3 RT-PCR检测外泌体中miR-21表达水平吸取20 l外泌体溶液，使用PureLink RNA试剂盒（美国Thermo Fisher公司）提取外泌体中RNA，Nanodrop 2000检测OD260/OD280＞1.8，将所得RNA逆转录成为cDNA模板，使用RTPCR技术检测miR-21在外泌体中的表达水平，样品均外送迪安医学检验公司检测。反应体系为20 l，包括上、下游引物各0.8 l、cDNA模板0.6 l、ddH2O 7.8 l、SYBRPPrimix Ex TaqTM10 l，反应条件95℃预变性10 min，95℃10 s，60℃60 s，共35个循环，以U6为内参，结果采用2－△△Ct法进行测定。所有引物均委托上海生工有限公司合成，miR-21引物为：F：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’；R：5’-TGCTTAGCTTATCAGACTG-3’。U6引 物 为：F：5’-GCTTCGGCAGCA-CATA-3’；R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3’。

1.3 统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验；相关性分析采用Spearman法，多因素分析采用Logistic回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床指标比较研究组BMI、FPG、FINS、TC、TG、LDL-C、HOMAIR、IL-6及IL-1均高于对照组，而HDLC水平低于对照组（均P＜0.05），见表1。

表1 两组临床指标比较

2.2 外泌体的鉴定电镜下观察外泌体为直径100 nm左右的双层膜圆盘状小囊泡，Western-blot结果为CD63、TSG101均有表达，而Calnexin无表达，确定提取物为外泌体而非细胞成分。见封四彩图6～7。

图6 Western-blot技术检测外泌体相关蛋白的表达

图7 电镜下外泌体形态鉴定

2.3 两组外泌体中miR-21水平比较研究组外周血来源外泌体中miR-21相对表达量为（1.32±0.31），对照组miR-21相对表达量为（0.72±0.25），研究组miR-21水平高于对照组（t=9.836，P＜0.05）。

2.4 miR-21与代谢指标的相关性T2DM患者外周血来源外泌体中miR-21表达水平与BMI、FINS、FPG、HOMA-IR、IL-6及IL-1呈正相关（r=0.471、0.407、0.395、0.513、0.492、0.413，均P＜0.05），而与HDL-C呈负相关（r=－0.412，P＜0.05），与年龄及性别无关（r=0.102、0.097，均P＞0.05）。

2.5 影响HOMA-IR的相关因素将BMI、TC、LDL-C、HDL-C、IL-6、IL-1、miR-21纳入多因素回归模型中，采用逐步法进行检测，结果显示BMI（=0.475，95%CI：0.005～0.024，P=0.001）及miR-21（=0.262，95%CI：0.041～0.153，P=0.031）是HOMA-IR升高的独立影响因素。

3 讨论

糖尿病的发病与胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗相关，并根据病因分为T1DM及T2DM，T1DM常见于自身免疫疾病导致的胰岛B细胞破坏，而T2DM常见于内分泌因素导致的胰岛B细胞功能失调及葡萄糖调节受损[4]。糖尿病会引起微血管、结缔组织和神经发生病理改变，诱发一系列骨骼和肌肉异常，常导致患者出现疼痛甚至残疾，危害患者健康。糖尿病常用药为二甲双胍、磺酰脲类及格列奈类等，主要作用为促胰岛素分泌及提高胰岛素敏感性，具有一定的副作用，且患者依从性不高，降低患者胰岛素抵抗是近年来糖尿病治疗领域的热门研究。

外泌体是一种细胞分泌的微小囊泡，几乎存在于所有真核生物，参与机体免疫应答和细胞间信号交流[5]。外泌体可携带多种生物信息分子，如miRNA、环状RNA及多种蛋白质[6]，而且能稳定存在于细胞外液中，有利于生物学检测。有研究表明外泌体能够作为一些疾病诊断及治疗的靶点而发挥作用[7]。miRNA是一种内源性短链非编码RNA，参与细胞调控细胞生命活动和代谢过程，有研究表明miRNA还参与胰岛素抵抗的发生[8]，和T2DM的发生密切相关。相关研究表明miR-21在T2DM患者血清中高表达，且对T2DM导致的急性心力衰竭具有诊断价值[9]。动物实验发现下调小鼠胰岛B细胞中miR-21水平能够缓解胰岛素抵抗，改善脂质代谢紊乱[10]。

本研究结果显示外周血来源外泌体中miR-21表达水平与IL-6、IL-1及HOMA-IR呈正相关（均P＜0.05），与文献[11]报道相似。本研究还发现miR-21为HOMA-IR升高的独立危险因素。有研究表明miR-21是一种炎症介质，在多种疾病中发挥促炎作用[12]，在T2DM中可能通过炎症反应介导胰岛素抵抗的发生及发展。这提示miR-21可能通过介导炎症的发生，使胰岛素抵抗水平升高，促进T2DM的发生及发展。