内皮微粒对血管内皮细胞衰老的影响及机制研究*

于博文，王 雪，胡艳红，杨 静，李雪丽，修成奎，雷 燕△

（1中国中医科学院医学实验中心，北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京100700；2中国中医科学院博士后科研流动站，北京100700）

血管内皮细胞衰老可导致血管功能障碍，是多种血管性疾病及衰老相关性疾病发生的始动因素［1］。除自由基、端粒、抗衰老基因、线粒体损伤、DNA损伤、蛋白质修饰以及热量限制等学说之外，内皮微粒（endothelial microparticles，EMPs）与衰老以及血管性疾病的关系引起了学者们极大的兴趣［2-3］。EMPs是从激活或损伤的内皮细胞上脱落的微小囊泡，其直径约0.1～1μm，含有胞质、膜蛋白、RNA和microRNA，具有母体细胞来源的膜磷脂结构及蛋白质成分，并携带有母体细胞源的膜表面分子标记物［4］。EMPs在生理情况下极少，参与细胞间信息传递，在炎症反应、血管损伤及细胞迁移等过程中发挥重要作用。近几年研究表明，这些经常被忽视的EMPs正逐渐成为内皮功能障碍的潜在指标，是反映内皮损伤的新标记物，其具有促凝活性，能够介导炎症反应［5］，并参与各种病理过程［6-7］。然而，人们对EMPs与血管衰老之间的关系知之甚少，鲜有报道衰老对EMPs分泌的影响及EMPs对内皮细胞衰老的作用。因此，本项工作以复制性人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）衰老为模型，探讨EMPs在HUVECs衰老中的意义及可能机制。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞人脐静脉内皮细胞购自ScienCell。

1.2 试剂内皮细胞培养液、胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素/链霉素溶液、胰酶/EDTA消化液0.05%、细胞冻存液和磷酸盐缓冲液均购自Scien-Cell；细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal）检测试剂盒购自Cell Signaling Technology；细胞衰老C12FDGlacZ基因表达试剂盒和CountBrightTMAbsolute Counting Bead均购自Molecular Probes；细胞周期PI/RNase染色缓冲液和Annexin V/FITC均购自BD；PE anti-human CD31 Antibody购自Biolegend；DCFDA细胞活性氧检测试剂盒购自Abcam；抑制剂VAS-2870、indomethacin和rotenone均购自Sigma-Aldrich；抑制剂apocynin和sulfaphenazol购自APExBIO。

1.3 仪器倒置相差显微镜及成像系统（麦克奥迪实业集团有限公司，AE2000）；细胞培养箱（Thermo，Forma 370）；流式细胞仪（Beckman，Cytomics FC500、CytoFLEX LX；BD，Accuri C6）；透射电子显微镜（Hitachi，H-7650）；超速离心机（Beckman，Optima L-100 XP）。

2 方法

2.1 细胞培养将HUVECs置于37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞密度在90%以上时传代。弃掉原培养液，DPBS清洗后加入胰酶/EDTA消化液，等细胞皱缩变圆时终止消化，收集细胞并离心。弃上清后重悬，按照1∶2传代培养。

2.2 复制性衰老模型的建立及分组通过传代的方法将HUVECs培养至10～12代，建立复制性衰老模型。年轻内皮细胞（young endothelial cells，young ECs）采用第2～4代HUVECs；衰老内皮细胞（aged endothelial cells，aged ECs）采用第10～12代HUVECs。实验分为young ECs组、aged ECs组及EMPs干预组（EMPs+young ECs组）。

2.3 SA-β-gal细胞化学法染色及荧光法染色SAβ-gal活性的检测方法包括细胞化学法和荧光法：细胞化学法简单、快速，但需在显微镜下选择视野，人工计算细胞数量；荧光法分析更为灵敏，是在群体和单个细胞水平上定量SA-β-gal阳性细胞的最佳方法，该方法将活细胞与C12FDG（一种β-gal底物）同时孵育，而C12FDG被β-gal裂解后会产生荧光，因此可用流式细胞仪检测和定量。

细胞化学法：将第2代及第10代细胞以5×107/L接种于6孔板中，待细胞贴壁后吸除细胞培养液，用DPBS洗涤1次，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 mL，室温固定15 min后，吸除细胞固定液，用DPBS洗涤细胞2次，每孔加入β-gal染色工作液1 mL，置于无CO2的37°C培养箱中孵育过夜后，于倒置光学显微镜下观察并拍照。

荧光法：将细胞接种于6孔板中培养至所需融合度，吸除原培养液，加入含300μmol/L氯喹的培养基孵育1 h，吸除后加入含33μmol/L C12FDG的培养液孵育1 h，吸除后用冷DPBS洗涤1次，消化细胞后用流式细胞仪（BDAccuri C6）检测荧光强度。

2.4 PI单染法检测细胞周期消化并收集细胞，500×g离心5 min，弃上清。将细胞悬液加入70%冷乙醇中，固定过夜。500×g离心5 min，弃上清。加入400μL PI/RNase染色液，充分混匀细胞后，37°C孵育15 min后上流式细胞仪（Beckman Cytomics FC500）检测。

2.5 两步离心法分离出内皮细胞膜微粒在无菌条件下，通过两步离心法从衰老细胞的培养基中收集EMPs。在室温下800×g离心15 min，去除细胞和细胞碎片；然后在13 000×g、4°C下离心60 min，弃上清，用缓冲液或培养液重悬微粒用于检测或干预培养。

2.6 透射电镜观察内皮微粒采用醋酸双氧铀负染法，在染色前将染液从4℃拿出，恢复室温后再进行如下操作：（1）取EMPs悬浮液20μL，滴于碳膜铜网上，室温静置1 min，用滤纸从铜网边缘吸去多余样品；（2）将染色液滴在铜网上，留置1 min，然后用滤纸吸去残留液；（3）室温干燥铜网，透射电镜下观察并拍照。

2.7 流式细胞术检测内皮微粒首先，对EMPs进行标记。取已制备好的内皮微粒悬浮液样本50μL，加入5μL PE anti-human CD31 Antibody或FITCAnnexin V孵育15 min（加入CD31抗体的样本需在冰上孵育，加入Annexin V的样本需常温孵育），再加入400μL staining buffer或Annexin V binding buffer稀释待测。然后，用已知直径的标准微球对流式细胞仪（Beckman CytoFLEX LX）进行尺寸校准，圈定0.1 μm～1μm范围的门；最后，在上机检测前向样本中加入已知浓度的标定珠（Counting Beads），圈定相应的标定珠门，从而计数定量。计数算法为：concentration of sample as EMPs/μL=A/B×C/D，A=number of EMPevents，B=number of bead events，C=assigned bead count of the lot（beads/50μL），D=volume of sample（μL）。根据计数结果，对应地算出每组EMPs总量。在收取样本的同时对每组进行了细胞计数，因此数据最终的呈现形式为每103个细胞产生的EMPs数量。

2.8 细胞内活性氧检测消化并收集细胞，用含10μmol/L DCFDA的无酚红培养基重悬细胞进行染色，并在37°C下孵育30 min。染色完成后，用EMPs悬浮液处理细胞，4 h后上流式细胞仪分析。由488 nm波长激光激发，在535 nm（FL1通道）波长处检测。不需要干预处理的组在染色完成后直接上机检测。

3 统计学处理

采用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析，所有数据用均数±标准差（mean±SD）表示，3组或更多组的组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Student’st检验，以P＜0.05为有显著性差异。

结 果

1 建立并验证复制性衰老模型

对young ECs和aged ECs分别进行SA-β-gal细胞化学法染色和C12FDG荧光法染色。可观察到，与图1A中young ECs相比，图1B中aged ECs细胞体积明显增大，细胞间间隙增宽，SA-β-gal蓝染比例明显增多。图1B中蓝色轮廓区域为young ECs的流式荧光直方图，黑色轮廓为aged ECs的流式荧光直方图，可观察到aged ECs的荧光轮廓明显右移。对3次重复实验的中位荧光强度值（median fluorescence intensity，MFI）进行统计分析，结果显示与young ECs相比，aged ECs MFI值显著提高（P＜0.01），即aged ECs的SA-β-gal活性显著增强。以上两种方法的结果趋势一致，但由于荧光法更为灵敏，因此本研究后续实验采用荧光法来评价SA-β-gal活性。

用PI单染法对young ECs和aged ECs分别进行细胞周期检测，结果表明：与young ECs相比，aged ECs的G0/G1期细胞和G2/M期细胞所占百分比显著降低（P＜0.01），S期细胞所占百分比显著增高（P＜0.01），见图2。

2 透射电镜观察内皮细胞膜微粒的形态及大小

内皮细胞膜微粒直径在0.1～1μm之间，形态呈圆形或椭圆形，其囊泡膜结构完整，边缘清楚，轮廓清晰，见图3。

3 衰老对内皮细胞分泌内皮细胞膜微粒的影响

图4A中黑色箭头所指为对EMPs和标定珠（Counting Beads）所圈定的门。从图4B和图4C的流式散点图中可观察到，与young ECs相比，aged ECs所分泌的CD31+EMPs及Annexin V+EMPs均增多。图4D中统计结果显示，与young ECs相比，aged ECs所分泌的CD31+EMPs及Annexin V+EMPs均显著增多（P＜0.05）。相同条件下内皮细胞分泌的Annexin V+EMPs显著少于CD31+EMPs（P＜0.05），两种标记方式得到的数据变化整体趋势一致，具备可信度。

Figure 1.Difference of SA-β-gal activity between young and aged endothelial cells（ECs）.A：SA-β-gal staining of young ECs and aged ECs（scale bar=50μm）；B：flow cytometry of SA-β-gal fluorescence staining.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.图1 年轻组与衰老组SA-β-gal活性差异

Figure 2.Difference of cell cycle between young and aged endothelial cells（ECs）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.图2 年轻组与衰老组细胞周期的差异

Figure 3.Morphological changes and size of EMPsunder transmission electron microscope.The scale bar=100 nm.图3 透射电镜下EMPs的形态和大小

Figure 4.Difference in the amount of EMPs secreted by young and aged endothelial cells（ECs）.A：the gates of EMPs and counting beads；B：scatter plot of CD31+EMPs；C：scatter plot of Annexin V+EMPs；D：difference of EMPs secreted by young and aged ECs.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs young ECs；#P＜0.05 vs CD31+EMPs.图4 年轻组与衰老组分泌EMPs数量的差异

4 内皮微粒对内皮细胞早衰的影响

用流式细胞术C12FDG荧光法检测EMPs干预young ECs后，SA-β-gal活性的变化情况。图5A中蓝色轮廓区域为young ECs的流式荧光直方图，红色轮廓为EMPs干预young ECs 48 h后的流式荧光直方图。可看出EMPs干预young ECs后，荧光轮廓明显右移。图5B统计分析结果显示，EMPs干预young ECs后，MFI值显著提高（P＜0.01），即SA-β-gal活性显著增强。

与young ECs相比，EMPs干预young ECs 48 h后G0/G1期细胞和G2/M期细胞所占百分比显著降低（P＜0.01），S期细胞所占百分比显著增高（P＜0.01），见图6。

5 内皮细胞膜微粒对细胞内活性氧的影响

Figure 5.Change of SA-β-gal activity of young endothelial cells（ECs）treated with EMPs for 48 h.A：C12FDGfluorescence staining histogram of young ECs treated with aged EMPs；B：change of SA-β-gal median fluorescence intensity（MFI）of young ECs treated with aged EMPs.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.图5 EMPs干预young ECs 48 h后SA-β-gal活性的变化

图7A中蓝色轮廓区域为young ECs内ROS的流式荧光直方图，黑色轮廓为aged ECs内ROS的流式荧光直方图，可观察到aged ECs内ROS的荧光轮廓明显右移。图7B中统计结果显示，与young ECs相比，aged ECs内ROS的MFI值显著增高（P＜0.01），即衰老内皮细胞内ROS水平显著高于年轻内皮细胞。

图8A中蓝色轮廓区域为young ECs内ROS的流式荧光直方图，红色轮廓为EMPs干预young ECs 4 h后的ROS直方图，灰色轮廓为干预的同时加入氧化应激抑制剂后（以apocynin为例）的ROS直方图，从图中可观察到EMPs干预young ECs后，ROS的荧光轮廓明显右移，而在干预的同时加入抑制剂可使ROS的荧光轮廓右移减少。图8B中统计结果显示，与young ECs相比，EMPs干预young ECs后，细胞内ROS的MFI值显著增高（P＜0.01），而在同时加入抑制剂Apocynin或Rotenone后，EMPs所诱导增高的ROS被显著抑制（P＜0.05）；抑制剂VAS-2870、indomethacin和sulfaphenazol则未能起到该作用。

讨 论

血管内皮细胞衰老是血管老化的重要病理改变，并且在内皮功能障碍及相关性血管疾病中发挥重要作用［8］。Raitoharju等［9］提出内皮微粒可通过多种分子途径影响血管衰老，从而调控动脉粥样硬化的早期和晚期阶段。Diehl等［10］证实微粒是miRNAs的主要转运载体，由其母细胞进行特异性包装，并通过血液中循环的微粒将基因调节功能从微粒释放细胞转移到靶细胞上。而miRNA被报道可参与内皮细胞衰老的调控机制，影响内皮细胞和平滑肌细胞的血管反应性和血管重建［9，11］。此外，研究表明微粒脱落增多与内皮功能障碍有关，而内皮功能障碍是衰老及血管性疾病的主要表现［12-13］。因此，EMPs与内皮细胞衰老之间的关系值得深入研究，目前关于衰老对EMPs分泌的影响及EMPs对内皮细胞衰老的作用的研究报道较少。

在本研究中，我们观察到EMPs为圆形或椭圆形、边缘清楚、轮廓清晰的囊泡。并进一步对不同状态下内皮细胞分泌EMPs的数量进行分析。流式细胞术是目前分析EMPs的金标准，其具体方法为：首先用已知直径的标准微球进行尺寸校准，圈定0.1～1μm范围的门；其次对EMPs进行标记，同时定量。标记EMPs常用的方法有两种：其一，由于内皮细胞以出芽的方式分泌EMPs，其囊泡膜表面同样也含有细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）分子。Annexin V是Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，与PS有超强的亲和力，因此可用Annexin V标记PS+EMPs；其二，由于微粒携带有母体细胞源的膜表面分子标记物，因此可用相对应的抗体来标记微粒。EMPs自身带有特异性抗原CD31分子，因此可用CD31抗体来标记CD31+EMPs。定量EMPs也有两种方法：一是在分析前的样品中加入已知浓度和体积的微球，间接计算样品微粒浓度；二是预先确定流式细胞仪的流速，则可计算每个分析体积的样品微粒数［14］。有研究报道EMPs在脱落时其囊泡表面可能未携带PS分子，致使少部分EMPs未能与Annexin V结合［15］。为避免分析结果不准确，本研究采用CD31抗体和Annexin V两种标记方式，证明了衰老内皮细胞分泌的EMPs显著增多。

Figure 6.Change of cell cycle of young endothelial cells（ECs）treated with EMPs for 48 h.A：cell cycle histogram of young ECs treated with EMPs；B：change of cell cycle distribution of young ECs treated with EMPs.Mean±SD.n=3.*P＜0.01 vs young ECs.图6 EMPs干预young ECs 48 h后细胞周期的变化

既往研究表明，在糖尿病大鼠中，内皮微粒随着年龄增长而增加［16］；在血栓性老年小鼠中，白细胞来源的微粒也增加［17］。在正常人中，表达p选择素的血小板微粒随着年龄增长而增加［18］。相反，Forest等［19］报道75岁及以上的人内皮微粒减少。以上研究对衰老过程中微粒水平的报道相互矛盾，并且都涉及到体内血浆微粒水平的测量，而其中微粒清除率可能是血浆微粒水平的重要决定因素。因此，为了避免微粒清除机制等可能的混杂因素，本研究使用内皮细胞复制性衰老模型［20-21］，在体外检测内皮微粒的分泌数量。

衰老会引起细胞体积增大、细胞周期改变以及pH依赖性β-半乳糖苷酶表达等［22-23］。目前，SA-β-gal活性是研究细胞衰老的常用生物标志物。因此，本研究联合采用了SA-β-gal染色法及细胞周期检测两种方式对衰老进行表征，首先验证了复制性衰老模型的建立，即与年轻内皮细胞相比，衰老内皮细胞的SA-β-gal活性增强，且细胞周期阻滞于S期。进一步，通过EMPs干预年轻内皮细胞后SA-β-gal活性增高及细胞周期阻滞于S期，证明了衰老内皮细胞分泌的EMPs可导致年轻内皮细胞早衰。

内皮活性氧主要来源于线粒体、内皮一氧化氮合成酶（eNOS）和NADPH氧化酶4（Nox4）［24］。过量ROS是氧化应激的主要原因，也是内皮衰老及相关疾病的主要原因之一。既往研究表明，氧化应激是内皮细胞衰老的主要诱因，可介导AngⅡ诱导的血管内皮细胞早衰及复制性内皮细胞衰老［25］。虽然ROS与内皮细胞衰老密切相关，然而内皮微粒是否通过ROS介导内皮细胞衰老尚不完全清楚。本研究明确了衰老内皮细胞产生的EMPs可诱导年轻内皮细胞发生氧化应激，这可能是EMPs介导年轻内皮细胞早衰的原因。并且该过程可部分被抑制剂Apocynin或Rotenone阻碍，说明了EMP诱导产生的ROS部分来源于NADPH氧化酶和线粒体的激活。

Figure 7.Difference of reactive oxygen species between young and aged endothelial cells（ECs）.A：flow cytometric histogram of ROSin young and aged ECs；B：difference of ROSfluorescence intensity between young and aged ECs.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.图7 年轻组与衰老组细胞内ROS的差异

Figure 8.Changes of ROSlevel in young endothelial cells（ECs）after treatment with EMPs.A：flow cytometric histogram of ROSin young ECs treated with EMPs and apocynin；B：changes of ROSfluorescence intensity in young ECs treated with EMPs and inhibitors.Apocynin：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase inhibitor；VAS-2870：NADPH oxidase inhibitor；indomethacin：cyclooxygenases inhibitor；Sulfaphenazol：cytochrome P450 inhibitor；rotenone：mitochondrial oxidase inhibitor.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs young ECs group；$P＜0.05 vs EMPs group.图8 EMPs干预young ECs后细胞内ROS水平的变化

综上所述，本研究表明衰老内皮细胞分泌的EMPs多于年轻内皮细胞，衰老内皮细胞分泌的EMPs可导致年轻内皮细胞早衰及细胞周期阻滞。此外，衰老内皮细胞分泌的EMPs可通过NADPH氧化酶和线粒体的激活，诱导年轻内皮细胞内ROS水平增高。因此，EMPs可能通过诱导细胞内ROS水平增高，从而介导内皮细胞早衰，但其具体机制尚需深入研究。