白腐菌共发酵稻秆制备染料吸附剂的研究

李慧星， 许 彬， 哈海洋， 陈旭升， 罗建成

(1.南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室 河南 南阳 473004； 2.南阳理工学院生物与化学工程学院 河南 南阳 473004； 3.江南大学生物工程学院 江苏 无锡 214122)

水稻秸秆是一种农业废弃物，利用稻秆作为植物性吸附剂用于治理工业染料废水是近些年的研究热点[1-5]。然而，稻秆的木质纤维具有结构顽固、化学惰性、染料吸附量小的缺点[1-3]。白腐菌发酵是一种低成本的清洁技术[6-9]，该技术已应用于生物质能源[10]、生物质制糖[11]、生物质生产饲料[12]等领域。此外，利用白腐菌之间的相互作用和底物差异性，多菌种共发酵能够发挥菌株及其酶系的互补协同作用[13-17]。Hiscox[18]等研究指出真菌对空间和营养的竞争，它们的相互作用会有两个结果：代替(Replacement)和僵持(Deadlock)。Qi-he[19]等研究了6种白腐菌Bjerkanderaadusta、Phlebiaradiata、Pleurotusostreatus、Dichomitussqualens、Hypoxylonfragiforme、Pleurotuseryngii，将它们两两组合共发酵，结果表明白腐菌Phlebiaradiate和Dichomitussqualens共发酵的漆酶活力达到120 U/mg。Ma[20]等研究表明白腐菌AuriculariapolytrichaAP和IrpexlacteusCD2共发酵提高了玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素的降解率。Kuhar[21]等研究表明白腐菌Ganodermalucidum和Trametesversicolor共发酵提高漆酶活力，显著提高木屑的选择型降解系数(木质素降解率/纤维素降解率)。Koroleva[22]等研究表明，Cerrenamaxima、Coriolushirsutus纯种发酵木屑，Cerrenamaxima和Coriolushirsutus共发酵木屑的木质素降解率分别为45%、58%和68%。

白腐菌纯种发酵稻秆已应用于产沼气[23]和产乙醇[24]的研究，多以稻秆为基质筛选不同的白腐菌组合，白腐菌共发酵稻秆制备吸附剂尚未见报道。实验选用了14种白腐真菌(灵芝、香菇、黑木耳、猴头菌、胶韧革菌、羊肚菌、银耳、平菇、毛栓菌、云芝、蛹虫草、乳白耙菌、毛木耳、黄孢原毛平革菌)，菌种两两组合后在平板上培养，直观分析菌株的相互作用；筛选出生长相容型菌种组合和生长拮抗型菌种组合后，接种于稻秆进行固态发酵制备吸附剂；以对典型偶氮染料刚果红[25]的吸附量为指标，筛选出共发酵稻秆的最优菌种组合；分析白腐菌及其组合发酵稻秆过程中的酶活和组分变化，阐释组合白腐菌共发酵稻秆制备染料吸附剂的机理，研究结果为白腐菌发酵秸秆制备染料吸附剂提供参考，以期实现染料吸附剂的绿色制造。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

14种白腐真菌(表1)均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)。水稻秸秆：粉碎过40目筛，备用。纤维素含量(30.04±0.51)%；半纤维素含量(23.34±0.22)%；木质素含量(11.51±0.19)%。马铃薯购于南阳市万德隆超市。

表1 实验菌种名称及编号

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、酒石酸、木聚糖、羧甲基纤维素、刚果红购于天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂粉(生物试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司；维生素B1(生物试剂)，东北制药集团股份有限公司；2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

马弗炉YW-M-1000，上海永威炉业有限公司；F800纤维测定仪，济南海能仪器股份有限公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱，上海恒勤仪器设备有限公司； TU-1901双光束紫外分光光度计，上海析谱仪器有限公司；PLUS384 酶标仪：美国分子仪器公司；3K15 高速冷冻离心机：德国SIGMA 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白腐真菌平板培养

白腐真菌接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上，在温度25 ℃、相对湿度75%的条件下培养10 d。

1.2.2 菌株相互作用实验

14种白腐菌两两组合，共有91个组合。分别挑取两种白腐菌菌丝接种于平板左右两侧，距离边缘2 cm。接种后在温度25 ℃、相对湿度为75%的恒温恒湿培养箱中培养10 d。观察记录两种不同真菌在平板上的生长情况。

1.2.3 白腐菌发酵稻秆

按料水比1∶3(w/v，g/mL)，在240 mL组培瓶中装入5.0 g稻秆和15 mL蒸馏水，搅拌均匀，密封后在121 ℃下灭菌30 min，冷却备用。

按照1.2.1节方法培养菌株后，将其在平板上切割成0.5 cm×0.5 cm菌块。纯种发酵时接种4个菌块于装有稻秆的组培瓶中；组合白腐菌共发酵时，每个菌种挑取2个菌块接种于装有稻秆的组培瓶中。接种后在温度25 ℃，相对湿度为75%的条件下固态发酵15 d。发酵结束后将培养物置于105 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎过40目筛后得到染料吸附剂。

1.2.4 吸附剂吸附刚果红

称取0.1 g吸附剂置于250 mL三角瓶中，加入50 mL 200 mg/L刚果红溶液，密封后置于30 ℃摇床中120 r/min震荡4 h达到吸附平衡，离心(4000 rpm，10 min)取上清液测定，计算吸附量[23]。实验重复3次，结果取平均值。

1.3 测定方法

刚果红测定方法参考文献[25]；纤维素、半纤维和木质素测定方法参考文献[26]；纤维素酶、木聚糖酶测定方法参考文献[27]；漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶测定方法参考文献[25]。

2 结果分析

2.1 不同白腐菌的相互作用

两种白腐菌在同一平板上培养生长，在相同培养条件下，两种菌株生长速度接近，菌丝布满平板时，在两种菌株结合处菌丝能够相互交融在一起，这种组合属于生长相容型(图1(a))；两种菌株生长速度接近，菌丝布满平板时，在两种菌株结合处有明显分界线，这种组合属于生长拮抗型(图1(b))；一种菌株生长速度快，另外一种菌株生长速度慢，生长速度快的菌株在平板上占据了绝大多数面积，这种组合属于生长差异型(图1(c))。两种白腐菌在同一平板上培养时，由于对空间的竞争，它们最终会僵持或替代[18]，可以看出，僵持会有两种结果，分别是生长相容(图1(a))和生长拮抗(图1(b))；替代的结果就是生长差异。

试验选择了14种白腐菌，研究了91个菌种组合的相互作用，结果如表2。91个菌种组合中，菌种相互作用结果是替代的有48个，占比52.7%；相互作用结果是僵持的有43个，占比47.3%，其中有35个菌种组合，如灵芝和香菇、灵芝和猴头菌等属于生长相容型，占比38.5%。有8个菌种组合，如灵芝和黑木耳、香菇和胶韧革菌等属于生长拮抗型，占比8.8%。

图1 白腐菌的相互作用类型

表2 白腐菌的相互作用结果

2.2 白腐菌发酵稻秆制备染料吸附剂

白腐菌的相互作用是替代，则菌种不宜用于共发酵。实验选择白腐菌相互作用是僵持的43个菌种组合(35个生长相容型、8个生长拮抗型)用于共发酵。分别研究了稻秆(编号0)、单个菌种(编号1～14，具体编号见表1)纯种发酵稻秆制备得到吸附剂、生长相容型菌种组合共发酵稻秆制备得到吸附剂、生长拮抗型菌种组合共发酵稻秆制备得到吸附剂对刚果红的吸附量，结果如图2所示。图2(a)显示了稻秆经白腐菌发酵后，提高了对刚果红吸附量。稻秆对刚果红吸附量为(33.12±1.03) mg/g，实验选择的14种白腐菌纯种发酵秸秆后，刚果红吸附量平均值为(37.98 ±2.05) mg/g，其中蛹虫草纯种发酵稻秆后，刚果红吸附量达到(41.38±0.59) mg/g。图2(b)至图2(d)显示了生长相容型菌种组合共发酵稻秆后，刚果红吸附量平均值为(40.13±2.67) mg/g，其中是银耳和羊肚菌共发酵稻秆后，刚果红吸附量达到(48.57±0.87)mg/g。图2(e)显示了生长拮抗型菌种组合共发酵稻秆后，刚果红吸附量平均值为(37.06±1.90) mg/g，其中是毛栓菌和乳白耙菌共发酵稻秆后，刚果红吸附量为(40.7±0.81) mg/g。从总体上分析可得，稻秆经白腐菌发酵后制备得到染料吸附剂对刚果红吸附量大于稻秆对刚果红吸附量；两种菌株共发酵的效果好于单个菌株纯种发酵；两种菌株共发酵时，生长相容型菌种组合共发酵的效果好于生长拮抗型菌种组合共发酵。

2.3 银耳和羊肚菌发酵稻秆的酶活分析

在试验选择的菌种组合中，生长相容型菌种组合银耳和羊肚菌共发酵稻秆后，刚果红吸附量最大，达到(48.57±0.87)mg/g。试验进一步分析了银耳纯种发酵稻秆、羊肚菌纯种发酵稻秆、银耳和羊肚菌共发酵稻秆过程中木质素降解酶(漆酶、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP))、纤维素酶、木聚糖酶的酶活变化。木质素降解酶的分泌表达取决于菌种、基质、培养方法和条件等[6,7]，MnP和LiP的酶活性未检测到，漆酶、纤维素酶、木聚糖酶的酶活变化如图3所示。图3(a)显示了发酵前6 d，3种方法得到的漆酶酶活差别不明显；发酵第9 d至15 d，银耳和羊肚菌共发酵的漆酶酶活明显提高。发酵15 d时，与银耳或羊肚菌纯种发酵稻秆相比，银耳和羊肚菌共发酵的漆酶酶活分别提高了42%和55%。图3(b)和图3(c)分别显示了纤维素酶和木聚糖酶的酶活变化。可以看出，与银耳和羊肚菌纯种发酵相比，银耳和羊肚菌共发酵时，纤维素酶的变化不明显，木聚糖酶的酶活力有一定程度的降低。与银耳或羊肚菌纯种发酵稻秆相比，银耳和羊肚菌共发酵稻秆第6天，木聚糖酶酶活力分别降低了22%和44%；银耳和羊肚菌共发酵稻秆第9天，木聚糖酶酶活力分别降低了5.6%和30%。

图2 白腐真菌发酵稻秆制备染料吸附剂对刚果红的吸附量

2.4 银耳和羊肚菌发酵稻秆的组分分析

图4显示了银耳纯种发酵稻秆、羊肚菌纯种发酵稻秆、银耳和羊肚菌共发酵稻秆过程中纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率。

图3 银耳和羊肚菌发酵稻秆的酶活变化

图4 银耳和羊肚菌发酵稻秆的组分变化

由图4可知，发酵时间0～9 d，纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率的增幅较大，在发酵时间9～15 d，它们的增幅逐渐减小。从图4(a)和(b)可以看出，与银耳或羊肚菌纯种发酵稻秆相比，银耳和羊肚菌共发酵稻秆的纤维素降解率基本一致，半纤维素降解率有一定程度降低。从图4(c)可以看出，银耳纯种发酵稻秆15 d，木质素降解率为(11.81±0.15)%，选择性降解系数0.85；羊肚菌纯种发酵稻秆15 d，木质素降解率为(14.09±0.03)%，选择性降解系数1.02；银耳和羊肚菌共发酵稻秆15 d，木质素降解率为(19.77±0.14)%，选择性降解系数1.55。

3 结论

实验研究了14种白腐菌91个菌种组合的相互作用，僵持的菌种组合有43个，其中35个菌种组合是生长相容型，占比38.5%；8个菌种组合属于生长拮抗型，占比8.8%。在白腐菌相互作用的研究基础上，筛选出生长相容型菌种组合银耳和羊肚菌共发酵稻秆制备染料吸附剂，对刚果红吸附量达到(48.57±0.87) mg/g，与银耳或羊肚菌纯种发酵稻秆制备染料吸附剂相比，吸附量分别提高了23%和27%。通过酶活和组分分析发现，与银耳或羊肚菌纯种发酵稻秆相比，银耳和羊肚菌共发酵稻秆15 d时，漆酶酶活分别提高了42%和55%，选择性降解系数提高了82%和52%。