柑橘提取物对肥育猪肠道抗氧化指标、消化酶活性、氨态氮含量以及粪便氮、磷、臭气含量的影响

崔艺燕 田志梅 邓 盾 鲁慧杰 刘志昌 王 刚 马现永,2*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州 510640；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525000)

目前，我国已禁止在饲料中使用促生长类抗生素。然而，在集约化和规模化的高密度和高强度生产中，氧化应激和炎症反应存在于整个养殖过程。促生长类抗生素的禁用，会导致养猪业产能下降。因此，为提高机体抗氧化能力和消化吸收功能，改善动物的生长性能和保证产品安全，同时减少粪污和臭气排放，开发绿色健康的抗生素替代品是十分必要的。由于植物提取物的安全性和促生长作用，植物提取物已被考虑作为促生长类抗生素替代品。柑橘提取物具有来源稳定、原料廉价易得等优势，充分利用柑橘产业废弃物资源，减少合成化学品或抗生素的使用，是一种高效、健康的资源化利用策略，对养殖业的可持续发展具有重要意义。

柑橘富含橙皮苷、柚皮苷、橘皮素和川陈皮素，是人类饮食中黄酮类化合物的关键来源[1]。柑橘提取物具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[2]等多样的活性功能，在制药、食品和保健品等领域具有广泛的应用，是潜在的饲用抗生素替代品之一。已有研究表明，柑橘提取物能够预防过氧化氢诱导的氧化应激，减少活性氧的产生和膜脂过氧化[4]。柑橘提取物对猪痢疾短螺旋体菌株具有很好的杀菌效果[5]。此外，动物试验表明，柑橘活性化合物可提高绵羊机体的抗氧化能力[6]。热环境条件下，柚皮苷提高了羔羊平均日增重和饲料转化率[7]。柚皮苷也可提高仔猪的增重、饲料转化率以及营养物质消化率，改善生长性能[8]。柑橘提取物对肉鸡[9]和仔猪[10-11]的免疫能力和肠道健康也有积极效果。

养猪过程中，动物粪便会排放出大量有害气体、氮和磷，这会对动物和人类健康产生不利影响，另外，动物肠道不适会增加污染物的排放。通过改善肠道抗氧化能力，提高消化酶活性，增加动物对营养物质的利用，可减少氮、磷的排放，继而减少臭气的产生。目前，未见柑橘提取物在肥育猪生产的相关研究报道，尚不清楚柑橘提取物对猪肠道抗氧化功能有无不利影响，消化酶活性是增高或是降低，氮、磷和臭气排放是否降低。因此，本研究评估了补充柑橘提取物对肥育猪肠道抗氧化指标、消化酶活性、氨态氮含量以及粪便氮、磷和臭气含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金霉素购自广东某饲料科技有限公司，柑橘提取物由广东某环保科技发展有限公司提供。柑橘提取物中含有3.04%维生素C、2.38%维生素E、2.89%柠檬酸和20.77%总黄酮。

1.2 试验设计

选取108头56日龄、体重(19.73±0.39) kg的“杜×长×大”肥育猪，公母各占1/2。按体重随机分配到3个组，每个组6个重复，每个重复6头猪。对照组饲喂基础饲粮，抗生素组在基础饲粮上添加75 g/t金霉素，柑橘提取物组在基础饲粮上添加柑橘提取物(56～112日龄250 mL/t，113～194日龄200 mL/t)。试验从仔猪体重20 kg左右开始，至120 kg左右结束。试验期138 d。

1.3 基础饲粮

基础饲粮参照NRC(2012)营养需要配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.4 饲养管理

试验在广东省农业科学院动物科学研究所猪场进行。根据猪场常规程序进行饲养管理。

1.5 样品采集和处理

在试验结束前1周的08:00—12:00收集新鲜粪便，一部分粪便用于测定臭气含量；余下粪便按5%比例添加10%盐酸进行固氮，然后65 ℃烘干72 h，-20 ℃保存。试验结束，每组选取每栏接近平均体重的1头肥育猪进行屠宰试验，收集回肠、盲肠、结肠肠道内容物，待测氨态氮含量。清理肠段内容物后，用0.9%生理盐水清洗肠段，再用载玻片刮取肠道(十二指肠、空肠、回肠)黏膜，-80 ℃保存。测定时，取约0.1 g肠道黏膜样品，加入9倍体积生理盐水制成10%组织匀浆液，4 ℃、3 500 r/min 离心15 min，取上清液进行测定。

1.6 指标测定

1.6.1 抗氧化指标

测定十二指肠、空肠、回肠黏膜样品的丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，以上指标测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，采用多功能酶标仪测定，具体操作按说明书进行。

1.6.2 消化酶活性

测定十二指肠、空肠、回肠黏膜样品的胃蛋白酶、胰蛋白酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、脂肪酶、淀粉酶和碱性磷酸酶(AKP)活性，以上指标测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，采用多功能酶标仪测定，具体操作按说明书进行。

1.6.3 氨态氮和粪便氮、磷含量

根据蒲万霞等[12]的方法，采用靛蓝酚蓝分光光度法测定回肠、盲肠、结肠内容物中氨态氮含量。采用凯氏定氮法测定粪便氮含量，采用钒钼黄比色法测定粪便磷含量。

1.6.4 粪便臭气(硫化氢和氨气)含量

使用手持泵式硫化氢检测仪(H2S/C-200)和手持泵式氨气检测仪(NH3/CR-200)分别测定粪便硫化氢和氨气含量。

1.7 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较。结果用平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10为有差异趋势。

2 结 果

2.1 柑橘提取物对肥育猪肠道抗氧化指标的影响

由表2可知，与抗生素组相比，柑橘提取物组十二指肠MDA含量降低了57.89%(0.05≤P<0.10)，且与对照组差异不显著(P>0.05)；各间之间十二指肠其他抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。与抗生素组相比，柑橘提取物组空肠MDA含量显著降低(P<0.05)，且与对照组差异不显著(P>0.05)；各间之间空肠其他抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。各间之间回肠抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。

表2 柑橘提取物对肥育猪肠道抗氧化指标的影响

2.2 柑橘提取物对肥育猪肠道消化酶活性的影响

由表3可知，与对照组相比，柑橘提取物组十二指肠胃蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，脂肪酶活性显著提高(P<0.05)，淀粉酶活性显著降低(P<0.05)。柑橘提取物组十二指肠消化酶活性与抗生素组差异不显著(P>0.05)。与对照组和抗生素组相比，柑橘提取物组空肠胃蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，淀粉酶活性显著降低(P<0.05)；与对照组相比，柑橘提取物组空肠胰蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，且与抗生素组差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，柑橘提取物组回肠淀粉酶活性显著降低(P<0.05)；抗生素组回肠淀粉酶活性与对照组和柑橘提取物组差异均不显著(P>0.05)。

表3 柑橘提取物对肥育猪肠道消化酶活性的影响

2.3 柑橘提取物对肥育猪肠道氨态氮含量和粪便氮、磷含量的影响

由表4可知，各组之间肠道氨态氮含量和粪便氮、磷含量无显著差异(P>0.05)。在数值上，柑橘提取物组回肠、盲肠、结肠的氨态氮含量最低。

表4 柑橘提取物对肥育猪肠道氨态氮含量和粪便氮、磷含量的影响

2.4 柑橘提取物对肥育猪粪便臭气含量的影响

由表5可知，各组之间新鲜粪便氨气和硫化氢含量无显著差异(P>0.05)。在数值上，柑橘提取物组肥育猪新鲜粪便氨气和硫化氢含量最低。各组之间24 h内粪便氨气和硫化氢含量无显著差异(P>0.05)。

表5 柑橘提取物对肥育猪粪便臭气排放的影响

3 讨 论

3.1 柑橘提取物对肥育猪肠道抗氧化指标的影响

肠道是机体消化吸收的主要场所，消化酶分解食物的同时会产生各种致氧化因子，这使得肠道容易处于氧化应激状态[13]。SOD、GSH-Px和CAT是体内重要的抗氧化酶[14]，是反映机体抗氧化能力的重要指标。T-AOC是反映机体抗氧化能力的综合指标。MDA是机体内氧化损伤的指标[14]。抗氧化剂系统不仅可以防止脂质和蛋白质氧化引起的损伤，还可以保持肠道屏障完整性，防止细菌感染[15]。本研究中，抗生素组空肠MDA含量显著高于对照组和柑橘提取物组，说明长期摄入抗生素对肠道健康有负面作用。与抗生素组相比，饲粮中添加柑橘提取物降低了十二指肠、空肠和回肠MDA含量，这表明柑橘提取物对机体抗氧化能力优于抗生素。本研究中，饲粮中添加柑橘提取物未能提高肠道抗氧化酶活性，而肠道MDA含量降低的原因可能是抗氧化系统中抗氧化物质(谷胱甘肽、维生素E、维生素C)含量提高造成的。迄今为止，鲜有研究报道柑橘提取物对动物肠道抗氧化能力的影响，多以纯化柑橘化合物研究为主。Bakar等[14]研究表明，柚皮苷降低了大鼠小肠MDA含量，增加了小肠SOD和GSH-Px活性。Guo等[16]报道，橙皮苷通过降低肠道MDA含量，增强肠道SOD活性和谷胱甘肽含量来改善结肠炎。这些研究均是以肠道受损动物模型进行研究，在应激状态下柑橘黄酮化合物表现出较好的抗氧化效果，但是这些研究未报道动物生长性能的相关数据。机体具有自我调节功能，柑橘提取物可能改善了机体其他功能。在前期试验中，与抗生素相比，柑橘提取物对仔猪生长性能和肠道抗氧化能力无显著影响，但能改善仔猪血液和肠道的免疫功能[10-11]，减少疾病的发生和药物的使用，对于猪群健康十分有利，有利于推广应用。

3.2 柑橘提取物对肥育猪肠道消化酶活性的影响

消化吸收不良会严重影响动物的生长和健康。小肠是营养物质消化吸收的主要部位[15]。消化酶在营养物质消化过程中起重要作用。Pi等[17]研究发现，抗生素不影响生长猪肠道消化酶活性。黄酮类化合物能调节肠道参与脂质和碳水化合物消化吸收的酶活性[18]。脂肪酶负责脂肪消化，是动物脂质利用的指标[19]。本研究发现，与对照组相比，柑橘提取物组十二指肠胃蛋白酶、脂肪酶活性显著提高，空肠胃蛋白酶活性显著提高。Yang等[20]研究表明，有机酸精油混合物提高了肉鸡肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性。课题组前期结果显示，柑橘提取物提高了仔猪肠道蛋白酶和脂肪酶活性[10]。柑橘提取物对仔猪和肥育猪消化酶活性的影响一致。蛋白酶活性的提高，可能是由于柑橘提取物刺激消化酶的分泌，激活了蛋白酶原。傅曼琴等[21]认为，川陈皮素、橘皮素及与橙皮苷组合可促进胃蛋白酶的分泌，并提高胃蛋白酶活性。蛋白酶活性提高可在肠道中产生更多的游离氨基酸，总体上提高蛋白质的消化利用率。柑橘提取物提高脂肪酶活性，使得产生的游离脂肪酸和甘油酯含量增加，提高脂肪消化吸收利用率，促进机体生长。

碳水化合物在肠道中被消化成葡萄糖并被吸收到体内，淀粉酶活性可以反映消化吸收的状态[22]。本研究发现，与对照组相比，饲粮中添加柑橘提取物降低了肥育猪十二指肠、空肠和回肠淀粉酶的活性，与以往研究结果[23]一致。Shen等[24]研究发现，柑橘黄酮显著抑制淀粉酶催化的淀粉消化，柚皮苷和新橙皮苷抑制直链淀粉消化，橙皮苷和川陈皮素抑制直链淀粉和支链淀粉的消化。淀粉酶活性受抑制，降低了机体对碳水化合物的消化，分解产生的葡萄糖会减少，可能影响动物健康。但是，本试验中柑橘提取物未降低肥育猪生长性能，这可能是由于淀粉酶活性降低，直链淀粉的消化减慢，导致到达后肠的直链淀粉含量增加，有利于微生物的生长代谢，继而产生高水平的短链脂肪酸，调控后肠代谢并改善动物健康[25]。另一种解释是，淀粉酶活性下降，中间产物麦芽糖含量减少，而在麦芽糖酶活性不变的条件下，碳水化合物的消化时间延长了，能产生足够量的葡萄糖为机体提供能量。在仔猪试验中，未发现柑橘提取物降低肠道淀粉酶活性[10]。仔猪消化系统未发育成熟，消化机能不完善。仔猪和肥育猪的肠道消化酶活性是不同的。柑橘黄酮类化合物在消化、吸收和分配过程的各个阶段的相互作用，对不同的消化酶产生不同的效果。总体上柑橘提取物改善了蛋白酶和脂肪酶活性，对机体营养物质消化吸收产生积极效果。柑橘提取物未表现出较好的促生长作用，与酶活性的提高不符，这可能是由于淀粉酶活性下降引起的，也可能是添加剂量以及使用时间造成的。目前的研究缺乏蛋白质、脂肪等营养物质消化率的研究，因此必须通过进一步试验来解释柑橘提取物对生长性能的影响。

3.3 柑橘提取物对肥育猪肠道氨态氮含量及粪便氮、磷含量的影响

肠道氨态氮含量过高对肠道健康有害。与抗生素组和对照组相比，柑橘提取物组肠道氨态氮含量降低了22.95%～36.48%。这可能是由于提取物中的类黄酮化合物引起的，也可能是蛋白质消化率的提高(蛋白酶活性提高)或微生物菌群导致的。

在养猪生产中，饲料消化效率低下会导致营养物质的排放增加。氮、磷排放的问题主要与猪和家禽的生产有关，育肥期生猪排泄物总量和氮含量比其他阶段的猪要高，氨气的排放量也高[26]。高含量的氮、磷排放到水体中，易造成富营养化，对动物和人类产生潜在健康危害[27]。本研究提示，柑橘提取物改善了肠道蛋白酶的活性，即机体吸收的蛋白质含量增加，则排出的氮含量减少。但是研究未发现粪便氮含量的减少，这是由于机体氮的吸收代谢并不能完全由蛋白酶活性的增加而决定，还受到其他酶系、内源性氮和微生物代谢等的影响。另外，粪便氮主要来源于未消化的饲粮氮、未被消化的微生物氮和内源氮，超过动物需要的氮一般通过尿液排出[28]。由于试验限制，未对尿液进行氮、磷含量的测定。后续若条件允许，应当进行消化代谢试验，以准确定量排泄物氮的排放，探讨柑橘提取物是否通过尿氮的形式实现减排。磷是动物体内含量最多的常量元素之一，主要存在于粪便中，尿液中较少[29]。暂未发现有关柑橘提取物对尿液氮、磷排放影响的研究，为了达到更好的减排效果，柑橘提取物对肥育猪氮、磷排放的影响需要更多后续试验研究。

3.4 柑橘提取物对肥育猪粪便臭气含量的影响

氨气和硫化氢是猪粪臭气的主要成分[30]，易引起动物呼吸道和组织损伤，损害机体健康，随接触时间的延长显著降低动物生长性能[31]。臭气的减少有利于动物生长性能的提高，通过营养调控减少臭气排放是经济可行的。与抗生素组相比，柑橘提取物组粪便氨气含量减少了约17%。这可能由于较高的蛋白酶活性改善了蛋白质消化率，减少了大肠中微生物的发酵底物，减少粪便氨气的排放。Lei等[32]研究表明，草药提取物对生长猪营养物质消化率和气体排放无显著影响。粪便臭气的排放与环境、饮食、营养状况等相关。研究表明，猪舍氨气含量小于20 mg/m3，对猪生长和健康无显著影响[33]。本试验中粪便氨气含量均低于20 mg/m3，可见本试验猪群生长环境较好，对猪健康生长无负面影响。

粪便含氮物在微生物作用下转化为氨态氮，是氨气的主要来源[33]，随时间的延长，氨气排放呈先上升后下降的趋势[34]。粪便排出后一般在24 h内被清理，因此本试验对存放24 h的粪便进行了臭气的测定，发现柑橘提取物对存放后的粪便臭气排放无显著影响，24 h粪便的氨气含量高于新鲜粪便。由于缺乏尿液臭气含量数据，目前尚不清楚柑橘提取物是否具有脲酶抑制剂的作用，能否减缓尿素或其他含氮物分解产生氨气的速度。低pH能破坏氨态氮转化氨气的化学平衡，减少氨气形成[35]。有研究报道，降低pH可减少肥育猪70%氨气的排放量[36]。但本试验中柑橘提取物未能降低粪便pH。这可能是由于添加剂量不足以改变肠道pH，也有可能是柑橘提取物并不是通过降低肠道pH实现氨气的减排。另外，臭气的产生与肠道微生物发酵、pH密切相关，不清楚柑橘提取物达到后肠被微生物利用的程度，是否改变了菌群结构。目前缺乏足够的研究探讨柑橘提取物对臭气减排的机理。

4 结 论

柑橘提取物改善了肥育猪肠道蛋白酶和脂肪酶活性，降低了淀粉酶活性，对肠道抗氧化能力及粪便氮、磷和臭气排放无负面影响。