不同益生菌对断奶山羊生长性能、血清生化指标以及粪便菌群的影响

卢佳伟 王金刚 高 琴 刘孜斐 陈姿利 黄群浩 张艳丽,* 王 锋,*

(1.南京农业大学动物科技学院，南京 210095；2.南京农业大学海门山羊研发中心，海门 216121；3.南通市海门区畜牧兽医站，南通 226100)

2020年7月1日我国饲料实行全面禁抗，如何减少禁抗所引发的各种问题，一方面需要我们为全面禁抗做好准备，另一方面要坚决遏制抗生素的滥用。过去人们使用了多种能够促进动物健康并且提高生长性能的饲料添加剂，尤其是抗生素被广泛使用，期望能够改善动物的消化道微生物，并提高生长性能和维持动物健康。但是，抗生素的长期使用将导致微生物的耐药性增强，对消费者的健康和环境构成威胁[1]。因此，人们寻求了绿色和安全的饲料添加剂，枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌应用较为广泛，被认为是安全可靠的人类和动物益生菌，这些菌具有抗菌、抗癌、抗氧化剂等特性。此外，它有很大潜力被用作抗菌药物的替代品，这在动物生产中滥用抗生素的背景下具有重要意义[2-3]。农业部在2013年12月30日发布的3045号公告《饲料添加剂品种目录(2013)》规定了可以作为添加剂添加到饲粮中的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌等34种菌种，其中枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌能够提高动物的消化率以及生长性能[4-5]。Kim等[6]将枯草芽孢杆菌饲喂韩国本地小母牛能够提高小母牛的生长性能并且改善健康状况；Jia等[7]在饲粮中添加了枯草芽孢杆菌、酿酒酵母与蛋白酶的复合生物制剂，饲喂育肥羔羊后发现提高了育肥羔羊的生长性能，改善了抗氧化能力与免疫功能，并且提高了瘤胃微生物的多样性；丁浩等[8]在饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够改善保育猪的血浆生化参数，降低腹泻率，进而提高生长性能。也有研究表明，饲喂生长育肥猪枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的复合物显著增加了干物质的消化率，并且增加了粪便中乳酸菌的数量[9]。枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂对断奶山羊生长性能影响的研究报道较少，因此，本研究将枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌单独饲喂以及联合饲喂断奶山羊，评估其对生长性能、腹泻率以及血清生化指标的影响，并且利用高通量测序技术检测其对粪便菌群的影响。探索枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂对生长性能与粪便菌群的影响是否优于单独饲喂，旨在为枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌在断奶山羊饲粮中的应用提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌活菌数≥1×1011CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数≥1×1011CFU/g。

1.2 试验动物与试验设计

选取60只体重相近、健康状况良好的3月龄海门山羊，随机分为4组，每组3个重复，每个重复5只羊，每个重复单圈饲养。对照组(C组)饲喂基础饲粮；枯草芽孢杆菌组(BS组)饲喂基础饲粮+400 mg/kg的枯草芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌组(BL组)饲喂基础饲粮+400 mg/kg的地衣芽孢杆菌；联合饲喂组(BS_BL组)饲喂基础饲粮+400 mg/kg的枯草芽孢杆菌+400 mg/kg的地衣芽孢杆菌。试验期间每天08:00与16:00分别饲喂1次，枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌每天随玉米粉混合后再饲喂给试验山羊。试验于2019年12月至2020年1月在海门山羊研发中心进行，预试期10 d，正试期30 d。

1.3 试验饲粮与饲养管理

试验前对羊舍进行全面消毒，试验期间定期对羊舍的地面、墙壁、栏杆、运动场地进行消毒与打扫，试验前对所有羊打耳标并注射驱虫药物。山羊饲喂的基础饲粮购自江苏波杜农牧股份有限公司，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能测定

分别于试验第1、10、20、30天对试验羊进行空腹称重，计算第1～10天、第11～20天、第21～30天与第1～30天每只山羊的平均日增重(ADG)。每日基础饲粮的添加量减去剩余饲粮量即为每日的日采食量，分别计算第1～10天、第11～20天、第21～30天与第1～30天每组山羊的平均日采食量(ADFI)，并计算料重比(F/G)。

ADG=试验羊个体总增重/试验天数；ADFI=每组试验羊总采食量/试验天数；F/G=ADFI/ADG。

1.4.2 腹泻率测定

每天记录每组试验羊的腹泻情况，并计算腹泻率。

腹泻率(%)=[(腹泻羊只数×腹泻天数)/(总试验羊只数×试验天数)]×100。

1.4.3 血清生化指标测定

分别于试验第1、10、20、30天对试验羊空腹颈静脉采血5 mL于促凝管中，静置30 min，3 000 r/min离心15 min，吸取上清于2 mL离心管中，-20 ℃保存待测。测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性以及白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Cr)和尿素氮(UN)的含量，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 粪便菌群测定

试验最后3 d用肛门试子收集各重复试验羊的粪便样品，将各重复的粪便样品混合，置于-80 ℃冰箱保存待测。将粪便样品送至杭州联川生物技术股份有限公司，16S rDNA V3～V4区测序粪便样品中的微生物菌群。

1.5 数据统计与分析

试验数据先用Excel 2010进行初步整理，再采用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用one-way ANOVA进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行多重比较检验，试验数据用平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊生长性能的影响

由表2可知，第10天，BS_BL组断奶山羊的体重极显著高于C组、BS组与BL组(P<0.01)，第20天与第30天，C组、BS组、BL组与BS_BL组间断奶山羊的体重无显著差异(P>0.05)；第1～10天，BS_BL组断奶山羊的ADG极显著高于C组、BS组与BL组(P<0.01)，第11～20天，C组、BS组、BL组与BS_BL组间断奶山羊的ADG无显著差异(P>0.05)，第21～30天，BL组与BS_BL组断奶山羊的ADG极显著高于C组与BS组(P<0.01)，第1～30天，C组、BS组、BL组与BS_BL组断奶山羊的ADG无显著差异(P>0.05)；试验第1～10天与第11～20天，C组、BS组、BL组与BS_BL组断奶山羊的ADFI无显著差异(P>0.05)，第21～30天，BS_BL组ADFI极显著高于C组、BS组与BL组(P<0.01)，第1～30天，BS_BL组ADFI显著高于C组、BS组与BL组(P<0.05)；第1～10天，BS组与BL组的F/G显著高于C组与BS_BL组(P<0.05)，第11～20天、第21～30天和第1～30天，C组、BS组、BL组与BS_BL组的F/G无显著差异(P>0.05)。这说明枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂能够显著增加断奶山羊的ADFI，单独饲喂无显著差异。因此,枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂能够提高断奶山羊的生长性能。

表2 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊生长性能的影响

2.2 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊腹泻率的影响

由表3可知，第1～10天和第11～20天，与对照组相比，BS组、BL组与BS_BL组断奶山羊的腹泻率显著降低(P<0.05)；第21～30天，BS组、BL组与BS_BL组间断奶山羊的腹泻率均无显著差异(P>0.05)；第1～30天，与对照组相比，BS_BL组断奶山羊的腹泻率显著降低(P<0.05)。这说明枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂能够显著降低断奶山羊的腹泻率。

表3 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊腹泻率的影响

2.3 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊血清生化指标的影响

由表4可知，第10天，与对照组相比，BS组的血清ALT和LDH活性显著降低(P<0.05)，ALB含量极显著降低(P<0.01)，UN含量和尿素氮/肌酐(UN/Cr)显著升高(P<0.05)，BS_BL组血清ALT活性显著升高(P<0.05)；第20天，与对照组相比，BS组血清UN/Cr和AST/ALT极显著升高(P<0.01)，BS组血清ALT、ALP和LDH活性极显著降低(P<0.01)，ALB、TG含量和CK活性显著降低(P<0.05)，BL组血清GLU和UN含量显著升高(P<0.05)，TG含量显著降低(P<0.05)，BS_BL组血清ALT活性和Cr含量极显著升高(P<0.01)；第30天，与对照组相比，BS组血清GLU含量、ALP、LDH活性显著降低(P<0.05)，AST活性和ALB含量极显著降低(P<0.01)，BL组血清UN含量显著升高(P<0.05)，BS_BL组血清AST活性和GLU含量显著降低(P<0.05)。

表4 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊血清生化指标的影响

2.4 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊粪便菌群的影响

2.4.1 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊粪便菌群丰富度和多样性的影响

2.4.1.1 粪便菌群Alpha多样性分析

Alpha多样性是指一个特定环境或生态系统内的多样性，主要用来反映物种的丰富度和均匀度。主要通过细菌操作分类单元(OTUs)稀释曲线、feature分布Venn图、Alpha多样性指数进行分析。C组、BS组、BL组与BS_BL组分别得到84 297、84 327、83 267和86 188个原始数据，经过双端拼接、质量控制、嵌合体过滤后得到76 847、66 677、72 843和71 296个有效数据，有效率分别达到91.16%、79.07%、87.48%和82.72%。由图1可知，4个组总共有1 991个OTUs，共同有42个OTUs，C组有209个差异OTUs，BS组有152个差异OTUs，BL组有254个差异OTUs，BS_BL组有976个差异OTUs。由图2可知，可观察到的OTUs数目中BS_BL组高于C组、BS组与BL组。由图3可知，BS_BL组的Shannon指数较大，多样性较高，说明枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂断奶山羊可以增加粪便菌群的多样性。

C：C组 C group; BS:BS组 BS group；BL：BL组 BL group;BS_BL:BS_BL组 BS_BL group。

图2 稀释曲线

图3 Shannon指数

由图4可知，物种丰富度曲线显示与C组相比，BS组、BL组与BS_BL组都增加了物种的丰富度，并且BS_BL组增加数目最多。由图5可知，BS_BL组的Chao1指数高于其他3组，反映了BS_BL组粪便菌群的丰富度较高，说明枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂断奶山羊可以提高粪便菌群的丰富度。

图4 物种丰富度曲线

图5 Chao1指数

2.4.1.2 粪便菌群Beta多样性分析

Beta多样性是指不同环境群落之间的物种差异性，Beta多样性与Alpha多样性一起构成了总体多样性或一定环境群落的生物异质性。Beta多样性通常计算环境样品间的距离矩阵，该矩阵包含2个任意样品间的距离，通过非加权距离主坐标分析(PCoA)可知总贡献率为74.48%，主坐标1(PCo1)的贡献率为46.87%，主坐标2(PCo2)的贡献率为27.61%，所有样本都已分开，说明不同处理对粪便菌群的影响不同，不同组间的距离较远，说明4个组间的微生物组成结构差异较大。

2.4.2 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊粪便菌群组成的影响

本次测序结果共得到2个界、12个门、22个纲、44个目、66个科、88个属和89个种。由图7可知，山羊粪便菌群中的优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、扁平菌门等。C组优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门(前3位)；BS组优势菌门为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门(前3位)；BL组优势菌门为拟杆菌门、变形菌门、浮霉菌门(前3位)；BS_BL组优势菌门为拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门(前3位)，由此看出各组的优势菌门略有不同。C组的优势菌属为堆囊菌属、土地杆菌属、球孢菌属(前3位)；BS组的优势菌属为野野村菌属、嗜红杆菌属、堆囊菌属(前3位)；BL组的优势菌属为副足杆菌属、野野村菌属、扁平菌属(前3位)；BS_BL组的优势菌属为Marinilabiliaceae_unclassified、假单胞菌属、Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified(前3位)(图8)。

图6 基于非加权距离的PCoA

Proteobacteria:变形菌门；Bacteroidetes:拟杆菌门；Actinobacteria:放线菌门；Firmicutes:厚壁菌门；Planctomycetes:扁平菌门；Verrucomicrobia:疣微菌门；Fibrobacteres:纤维杆菌门； Gemmatimonadetes:芽单胞菌门；Chloroflexi:绿弯菌门；Tenericutes:无壁菌门； Acidobacteria:酸杆菌门；Spirochaetes:螺旋体门； Synergistetes:互养菌门；Deinococcus-Thermus:异常球菌-栖热菌门；Cyanobacteria:蓝藻菌门；Halanaerobiaeota:嗜盐菌门；Deferribacteres:脱铁杆菌门；Elusimicrobia:迷踪菌门；Fusobacteria:梭杆菌门。

Nonomuraea:野野村菌属；Sorangium:堆囊菌属；Parapedobacter:副足杆菌属；Pedobacter:土地杆菌属；Pseudomonas:假单胞菌属；Altererythrobacter:嗜红杆菌属；Brevundimonas:单胞菌属；Sphaerimonospora:球孢菌属；Flavobacterium:黄杆菌属；Cellvibrio:纤维弧菌属；Proteobacteria_unclassified:未分类变形菌；Sphingobacterium:鞘氨醇杆菌属；Luteimonas:滕黄单胞属；Planctomicrobium: 假单胞菌属；Planctomycetales_unclassified:未分类浮霉菌；Devosia:戴沃斯菌属；Fibrobacteraceae_unclassified:未分类纤维杆菌；Candidimonas:白色单胞菌属；Actinomadura:马杜拉放线菌属； Christensenellaceae_unclassified:未分类克里斯滕森菌；Alphaproteobacteria_unclassified:未分类α-变形菌；Flavobacteria_unclassified:未分类黄杆菌； Hydrogenispora:氢孢菌属；Others:其他。

3 讨 论

3.1 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊生长性能与腹泻率的影响

提高动物的生长性能并且降低F/G被认为是益生菌的特征之一[10]。陈凤梅等[11]研究发现，饲粮中添加植物乳酸杆菌与地衣芽孢杆菌能够显著降低哺乳期犊牛的腹泻率，但对生长性能无显著变化。仲伟光等[12]研究发现，饲粮中添加复合微生物制剂(酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)后，育肥牛的干物质采食量与ADG分别提高2.74%和28.95%，F/G降低23.27%。也有研究表明，给断奶仔猪补充枯草芽孢杆菌能够显著增加最终体重和ADG，并且显著降低试验期内的F/G以及腹泻率[13-14]。本试验中枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂显著提高了断奶山羊的ADFI以及降低腹泻率，与C组相比，BS组、BL组、BS_BL组的F/G与ADG没有显著变化，说明枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂效果优于单独饲喂。采食量和日增重的提升可能是由于所添加的复合微生物制剂对瘤胃发酵起到了一定的调控作用。试验组F/G的降低说明复合微生物制剂不只是通过采食量的增加促使ADG的提升，而且对饲粮的消化吸收也具有调控作用。饲料转化率的提高可能来源于2方面因素：一是复合微生物制剂提高了瘤胃对营养物质的消化能力；二是其促进了机体对营养物质的吸收转运以及储备能力[12]。栾嘉明等[15]认为芽孢杆菌可能通过抑制有害菌群生长、改善瘤胃发酵环境及模式、增强营养物质消化、提高饲料能量利用率及提高动物免疫力等一系列作用，提高动物的生产性能。郑建婷等[16]报道枯草芽孢杆菌可使动物后肠道微生物生存环境得到改善，促进它们对营养成分的吸收，使动物机体抗疾病能力增强，从而提高生产性能。

3.2 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊血清生化指标的影响

机体血清中ALB含量的高低反映了肝脏合成蛋白质能力的强弱，UN含量的高低反映了机体蛋白质代谢水平[17]。ALB是血液中最重要的蛋白质，在转运代谢物、营养物质和维持胶体渗透压方面起着至关重要的作用[10]。本研究中，试验第30天BS组血清中ALB含量显著降低，可能是因为断奶山羊饲喂枯草芽孢杆菌后肝脏合成蛋白质的能力减弱，导致血清中ALB含量的降低。BL组与BS_BL组中血清UN的含量与C组相比显著提高，说明断奶山羊体内的氨基酸代谢旺盛，单独饲喂地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂后氮在断奶山羊的体内积累，不能及时排出体外，这与Czech等[18]研究报道的结果基本一致。

GLU和LDH是衡量机体糖代谢的主要指标[8]。第30天BL组血清GLU含量显著升高，说明饲粮中添加地衣芽孢杆菌能够增强断奶山羊对葡萄糖的消化吸收，提高机体对糖的利用能力。这与王晓丹等[19]研究报道的结果一致，其主要原因可能是由于地衣芽孢杆菌减少了断奶山羊的应激反应。本研究中，试验第30天BS组血清LDH活性显著降低，张俊瑜等[20]研究指出，基础饲粮中添加纳豆芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌后绵羊的血清LDH活性呈下降趋势，可能是因为枯草芽孢杆菌在肠道内增殖可产生枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素和短杆菌等生物活性物质，促进肠道内有益菌的增殖，抑制病原菌或条件致病菌的生长，进而提高饲粮的能量利用效率[8]。

畜禽血清中ALP与AST的活性是反映机体肝脏生理机能状况的重要指标[20]。血清ALT活性升高通常意味着肝脏功能障碍,ALP活性增加通常反映出心脏或肌肉组织功能障碍[21]。添加枯草芽孢杆菌后能够显著降低断奶山羊血清中ALP活性，说明饲喂枯草芽孢杆菌后断奶山羊的心脏和肌肉组织功能代谢正常，体况正常，能够维持机体肝脏的正常生理机能，这与贺长青等[17]研究报道的结果一致。基础饲粮中添加枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌后断奶山羊的血清生化指标会发生显著影响，具体影响不尽相同，联合饲喂并不能增强影响效果。

3.3 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌对断奶山羊粪便菌群的影响

BS组提高了放线菌门的丰富度，BL组与BS_BL组拟杆菌门的丰富度有所提高，有利于促进脂质的吸收，维持山羊的肠道屏障。肠道中拟杆菌门与厚壁菌门的比例会影响营养物质的吸收能力,枯草芽孢杆菌能够调控肠道的微生物群落[22]。与对照组相比，3个试验组变形菌门的丰富度下降，Sheng等[23]研究发现给猪补充纳豆枯草芽孢杆菌后显著改变了粪便中的细菌组成。曲湘勇等[24]研究发现饲粮添加枯草芽孢杆菌后，产蛋鸡盲肠菌群中拟杆菌门与变形菌门的相对丰度略有升高，但差异不显著，结果不尽相同可能是因为试验动物的种类、枯草芽孢杆菌菌株不同。据报道，几种拟杆菌门在蛋白质水解和肽类生成丙酸的过程中起主要作用[25]。Li等[26]研究发现饲喂小鼠枯草芽孢杆菌18，变形菌门的丰富度下降，厚壁菌门的丰富升高。王汉星等[27]通过KEGG功能预测与Cazy纤维素代谢发现饲粮中单独添加枯草芽孢杆菌会明显提高空肠中微生物的免疫系统、碳水化合物代谢、纤维素代谢。这可能是由于枯草芽孢杆菌的添加消耗了肠道内的大量游离氧，制造了厌氧环境进而促进了乳酸菌的丰度。枯草芽孢杆菌DSM32315通过抑制有害微生物并且促进有益微生物的生长来改善肠道平衡，肠腔内芽孢杆菌数量的增加突显了枯草芽孢杆菌DSM32315在小猪肠道内定植的能力，补充枯草芽孢杆菌DSM32315 能够改善肠道微生物的结构，从而促进断奶仔猪生长性能的提高[28]。试验结果表明饲喂断奶山羊枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌能够改变粪便菌群的结构。

4 结 论

① 饲粮中枯草芽孢杆菌(有效活菌数为1×1011CFU/g)与地衣芽孢杆菌(有效活菌数为1×1011CFU/g)联合饲喂能够显著提高断奶山羊的ADFI，显著降低腹泻率，联合饲喂的效果要优于单独饲喂。

② 饲粮中添加枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌后断奶山羊的血清生化指标会发生显著影响，具体影响不尽相同，联合饲喂并不能加剧影响效果。

③ 饲粮中添加枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌会改变断奶山羊粪便菌群的优势菌门，减少变形菌门的丰富度。