山药茯苓复合酵素的发酵工艺优化及其发酵前后总多糖含量对比分析

刘 斌，饶 智，李俊明，吴 钰，谢梦洲

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南长沙 410208）

酵素是指选取一种或多种新鲜水果、蔬菜、食用菌、中草药为基础原料，经乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种有益菌发酵而使原材料生物活性增强或产生新的生物活性的物质[1]。关于酵素的研究最早在20世纪初起源于日本，后来发展到欧美和我国台湾地区，成为了相当成熟的产业，有上千万消费者每天服用酵素产品[2]。近30年来，中国人的血脂水平逐步升高，血脂异常患病率明显增加。2012年全国调查结果显示[3]，中国成人血脂异常总体患病率高达40.40%，较2002年呈大幅度上升[4]。高脂血症是导致动脉粥样硬化进而形成心脑血管事件的主要因素之一，有效防治血脂异常是预防心脑血管疾病的重要途径[5]。目前，市面上流通的治疗药物对肝脏有一定损害及副作用，故不适合长期服用，患者顺应性差。因此，选取药食同源中药，开发具有防治高脂血症的保健食品具有广阔的市场前景和重要的社会科学意义。

山药甘、平，归脾、肺、肾经，有益气养阴、补脾肺肾、固精止带的功效。药理试验数据表明，山药多糖具有有效调节糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的作用[6]，可降低糖尿病小鼠体内血糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度，缓解体重减轻的状况。茯苓甘、淡、平，归心、脾、肾经，有利水渗湿、健脾、宁心的功效。茯苓有很好的利尿作用，健康人服用茯苓水煎剂，有明显的利水效果；对心源性水肿患者的利水效果非常好，日剂量100 g时效果最好[7]。目前，关于具有降血脂功能的药食同源中药酵素的研究鲜有报道。试验以山药[8]、茯苓[9]等5味药食同源中药为主要原料[10]，植物乳酸杆菌为发酵菌种，通过正交设计试验优化水提工艺及发酵工艺，总多糖含量和干浸膏得率为评价指标，采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸显色测定总多糖的百分含量，从而为山药茯苓复合酵素饮料开发成降血脂的功能性食品提供科学依据[11]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山药饮片，产地河南；茯苓饮片，产地湖南；植物乳酸杆菌CICC21790，中国工业微生物菌种保藏管理中心提供；MRS肉汤培养基BS1137，杭州百思生物技术有限公司提供；无水葡萄糖对照品，上海沃凯生物技术有限公司提供（批号：20080415）；苯酚，广东光华科技股份有限公司提供（批号：20160701）；硫酸，株洲市星空化玻有限责任公司有限公司提供（批号：20171120）；乙醇，上海沃凯生物技术有限公司提供（批号：20180413）；实验室用水为纯化水，试剂均为分析醇。

1.2 仪器与设备

UV900B型紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科产品；ATX124型电子天平，东京岛津仪器有限公司产品；HY-4型调速多用振荡器，常州荣华仪器制造有限公司产品；DIKW-S-6型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器产品；KM5200DE型超声波清洗器，昆山美美超声仪器产品；N-301010L型旋转蒸发器，日本东京理化产品；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份产品；SFY-20BL型水分测定仪，深圳市冠亚水分仪科技产品；HNYC-203T型智能恒温培养振荡器，天津欧诺仪器股份有限公司产品；TGL18W型高速冷冻离心机，长沙英泰仪器有限公司产品。

2 试验方法与结果分析

2.1 总多糖百分含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒质量的无水葡萄糖对照品20.4 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.204 mg/mL无水葡萄糖对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取各正交设计试验得到的水提物和发酵制得的干浸膏约0.5 g，加入80%乙醇100 mL先研磨，使之分散成混悬水溶液，再转移至三角瓶中，加热回流1.0 h，趁热滤过，滤渣与滤器用热80%乙醇30 mL分次洗涤，弃去滤液，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水150 mL，加热回流1.0 h，趁热滤过，同上操作，再重复提取1次[12]。用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，转移至500 mL量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀[13]。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.7，1.0 mL，分别置于10 mL具塞刻度试管中，再分别加水补至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入硫酸7 mL，密封；用调速多用振荡器混匀，放置10 min，置40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=0.037 8X+0.024 7，线性相关系数R=0.999 5，结果表明葡萄糖质量浓度在0～20.4μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 供试品溶液的测定方法

精密移取制备的供试品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，加水补至2.0 mL；精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸7 mL，密封；用调速多用振荡器混匀，放置10 min，置于40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算总多糖百分含量[14]。

2.2 山药、茯苓水提取物制备工艺优化

2.2.1 山药、茯苓水提取物制备的基本工艺

按处方比例称取山药、茯苓等5味中药饮片，加一定量纯化水超声浸泡一定时间，在一定的水浴温度下加热回流一定时间[15-16]，过滤；滤渣第二次加一定量纯化水，在一定的水浴温度下加热回流一定时间，过滤；合并2次滤液，用旋转蒸发仪在50℃，30 r/min，30 kPa的条件下减压浓缩至药材：浓缩液=1∶1左右，再冷冻干燥成干浸膏粉（含水量＜5.0%）。

2.2.2 山药、茯苓水提取工艺正交设计试验

取山药、茯苓共9份，每份按照正交设计试验因素水平表（表1）进行水提物（干浸膏）的制备，测定干浸膏得率[17]及总多糖含量。

水提取工艺因素与水平设计见表1，水提正交设计试验总多糖百分含量及干浸膏得率测定结果见表2，水提正交设计试验总多糖及干浸膏得率因素间方差分析见表3，水提正交设计试验总多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平间方差分析见表4。

表1 水提取工艺因素与水平设计

表2 水提正交设计试验总多糖百分含量及干浸膏得率测定结果

表3 水提正交设计试验总多糖百分含量及干浸膏得率因素间方差分析

表4 水提正交设计试验总多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平间方差分析

以总多糖百分含量为评价指标：A因素水平间差别皆具有统计意义，取A因素的1水平，即水提温度95℃，B、C、D因素可任意取值；以干浸膏得率为评价指标：A因素水平间差别皆具有统计意义，取A因素的1水平，即水提温度95℃，B因素水平间差别皆具有统计意义，取2水平或3水平，因2水平加水量少于3水平，故B因素取2水平，即加水量第1次为12倍，第2次为10倍。C因素水平间差别皆具有统计意义，取2水平或3水平，因2水平提取时间短于3水平，故C因素取2水平，即提取时间第1次为2.0 h，第2次为1.5 h。D因素可取任意值，因1水平超声浸泡时间最短，故D因素取1水平，即超声浸泡时间为0.5 h。

2.2.3 水提取工艺验证试验结果

对水提工艺所得到的优化工艺参数进行验证试验，取3批山药及茯苓饮片，每批总量1.0 kg，加纯化水量为药材量的12，10倍，超声浸泡时间为0.5 h，水提温度95℃，水提取时间为2.0，1.5 h，测得总多糖含量为8.796%，RSD=1.957%（n=3），干浸膏得率为7.514%，RSD=1.745%，验证结果略高于正交设计试验中的最高值，表明该工艺科学、合理、稳定、可行。

2.3 山药、茯苓复合酵素的发酵工艺优化

2.3.1 山药、茯苓复合酵素的发酵基本工艺

2.3.2 菌种的培养与分离

培养植物乳酸杆菌（MRS肉汤培养基，接种量0.1%，37℃，180 r/min振荡培养）至对数生长中后期，然后4℃条件下以转速10 000 r/min离心10 min弃上清液取菌体，无菌生理盐水洗涤菌体2次（重悬菌体后离心弃上清液），再加纯化水制成混悬液以备接种[18]。

2.3.3 山药、茯苓复合酵素的发酵工艺优化

（1）山药、茯苓复合酵素的发酵工艺正交设计试验。选取对发酵工艺影响较大的接种量、发酵温度、发酵时间3个因素进行考查，按干浸膏混悬水溶液体积的5%，10%，15%加入菌液进行发酵[19]，发酵液静置澄清2 h后，取上清液以转速8 000 r/min离心10 min，将上清液用0.45μm滤膜过滤，即得山药茯苓复合酵素水溶液，再冷冻干燥得山药茯苓复合酵素的干浸膏，计算干浸膏得率，测定总多糖百分含量[20]。

山药、茯苓复合酵素的发酵工艺因素与水平设计见表5，发酵工艺正交设计试验总多糖及干浸膏得率测定结果见表6，发酵工艺正交设计试验总多糖含量及干浸膏得率因素间方差分析见表7，发酵工艺正交设计试验总多糖各因素的水平间方差分析见表8。

表5 山药、茯苓复合酵素的发酵工艺因素与水平设计

表6 发酵工艺正交设计试验总多糖含量及干浸膏得率测定结果

干浸膏得率因素间方差分析皆无统计学意义，故不必进行水平间方差分析。

表7 发酵工艺正交设计试验总多糖及干浸膏得率因素间方差分析

表8 发酵工艺正交设计试验总多糖含量各因素的水平间方差分析

以总多糖百分含量为评价指标：A'、B'、C'因素水平间皆有统计意义，A'因素取2水平或3水平，即接种量10%或15%，考虑经济效益，取2水平为佳，即接种量10%；B'因素取2水平或1水平，即发酵温度31℃或34℃，考虑经济效益，取1水平为佳，即发酵温度31℃；C'因素取3水平，即发酵时间为72 h。以干浸膏得率为评价指标：A'、B'、C'、D'因素可任意取值，即同总多糖百分含量分析结果。

所谓的信息化人力资源管理主要指的是，组织中利用网络化的技术手段，在意识与战略性人力资源的支持下，展现较强的实践性实施。

（2）山药、茯苓复合酵素的发酵工艺验证试验结果。对山药、茯苓复合酵素的发酵工艺所得到的优化工艺参数进行验证：取3批山药、茯苓等5味药食同源中药的水提干浸膏（即2.2.3项下的干浸膏），加30倍纯化水研磨分散成混悬水溶液，加入混悬水溶液体积10%的菌液，在温度31℃，转速为180 r/min的条件下发酵72 h，将发酵液除菌后再冷冻干燥成干浸膏，测得总多糖百分含量为23.97%，RSD=1.843%（n=3），干浸膏得率为22.41%，RSD=1.972%，发酵工艺验证结果略高于正交设计试验中的最高值，表明该工艺科学、合理、稳定、可行。

2.4 山药、茯苓复合酵素发酵前后总多糖百分含量对比分析

将山药、茯苓复合酵素水提最优工艺与发酵最优工艺进行总多糖含量对比分析。

山药、茯苓复合酵素发酵前后总多糖百分含量对比分析见表9。

由表9可知，山药、茯苓等5味药食同源中药，经发酵后总多糖百分含量远远高于未经发酵的水提物中的总多糖百分含量，是发酵前水提物中总多糖百分含量的2.725倍。

表9 山药、茯苓复合酵素发酵前后总多糖百分含量对比分析

3 结论

（1）以总多糖百分含量和干浸膏得率为评价指标，优化后的山药茯苓复合酵素发酵工艺为发酵菌种植物乳酸杆菌，接种量10%，发酵温度31℃，发酵时间72 h。山药、茯苓水提液的最佳提取工艺为水提温度95℃，加水量第1次为12倍，第2次为10倍，取时间第1次为2.0 h，第2次为1.5 h，超声浸泡时间为0.5 h。在此工艺优化条件下，山药茯苓复合酵素的总多糖百分含量达23.97%是发酵前水提山药、茯苓等5味药食同源中药最优工艺总多糖百分含量（8.796%）的2.725倍。研究发现，通过植物乳酸杆菌发酵制作的山药茯苓复合酵素中降血脂活性成分总多糖百分含量比发酵前含量显著增加，很可能增强了产品的降血脂功能，为后期降血脂功能试验提供理论依据，且同类研究未见报道。

（2）在预试验中，采用同一份样品比较发酵前后总多糖百分含量测定结果就得知发酵后比发酵前总多糖含量高很多，但发酵前后的工艺皆未优化，不能准确阐述发酵前后总多糖百分含量的对比变化结果，故在正式试验时采用发酵前水提最优工艺3批验证结果与发酵的最优工艺3批验证结果进行比较，即得到了最科学合理正确的总多糖百分含量对比结果。

（3）试验中仅采用了植物乳酸杆菌作为发酵菌种，未进行多种菌种的比较是因为植物乳酸杆菌对植物性发酵原料具有较强的生物活性转化能力、且安全无毒，发酵工艺成熟，便于掌握，故最初选用该菌种进行预试，并且产生了预期的理想结果，故产品仅用植物乳酸杆菌作为发酵菌种。