复合维生素B片烟酰胺杂质烟酸测定方法建立

韩 君,张晓东

(内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古自治区 呼和浩特 010000)

烟酰胺称为3-吡啶甲酸，烟酸又称3-吡啶-甲酸。烟酰胺与烟酸统称为维生素PP,是人体必需的13种维生素之一。烟酰胺在酸或碱的条件下，可转化为烟酸。

1 材料与方法

Waters e 2695高效液相色谱仪；工作站：Empower；乙腈：色谱纯，SIGMA-ALDRICH； 纯净水：自制；磷酸二氢钾：分析纯,国药集团化学试剂有限公司；三乙胺：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

烟酸 (批号100434-201102 纯度：99.9%)中国食品药品检定研究院

烟酰胺(批号100115-201204 纯度：99.9%)中国食品药品检定研究院

复合维生素B片(批号1603004)天津力生制药股份有限公司

2 方法与结果

2.1 色谱条件

仪器：Waters 2695e高效液相色谱仪

色谱柱：Inertsil ODS2 C18 5μm 4.6×250mm

流动相：A 0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用三乙胺调节pH值至6.5)；B：乙腈

流速：0.8mL/min 检测波长：260nm 进样量：20μL

按下表洗脱：

时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)0.0115.0015.1040.0040.1060.0099992020999911808011

2.2 对照品溶液制备

精密称取烟酸对照品17mg，置50mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含3.4μg的溶液。

2.3 供试品溶液制备

取供试品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于烟酰胺34mg)，置50mL量瓶中，加水振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称取烟酸对照品适量，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含0.68mg的溶液，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中如有与烟酸保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，即得。

3 结果

3.1 破坏实验

酸破坏试验：取对照品溶液(取烟酰胺对照品34mg,按测定法供试品溶液配制)10mL,加1mol/L盐酸溶液0.5mL，避光放置1h，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按烟酸项下色谱条件测定。

碱破坏试验：取对照品溶液(取烟酰胺对照品34mg,按测定法供试品溶液配制)10mL,加1mol/L氢氧化钠溶液0.5mL，避光放置1h，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至中性，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按烟酸杂质项下色谱条件测定。

氧化破坏试验：取对照品溶液(取烟酰胺对照品34mg,按测定法供试品溶液配制)10mL,加30%双氧水溶液3滴，避光放置1h，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按烟酸杂质项下色谱条件测定。

热破坏试验：取对照品溶液(取烟酰胺对照品34mg,按测定法中供试品溶液配制)10mL,置70℃水浴加热2h，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按烟酸杂质项下色谱条件测定。

光破坏试验：取原料药供试品粉末，置紫外灯(UV254nm)下照射24h，取粉末34mg,精密称定，照供试品溶液配制，按烟酸杂质项下色谱条件测定。

小结：通过母液与各个破坏后的供试品溶液比较，可知，强碱，强氧化条件下可明显增大破坏原有的烟酰胺主峰，从而产生烟酸；且经上述破坏后，主峰和杂质峰均能很好分离，说明该色谱条件可行。

3.2 阴性空白试验

取不含烟酰胺的阴性空白进行检测，依照厂家提供处方量(辅料及处方由天津力生制药股份有限公司提供)，分别称取维生素B1 0.3g、维生素B2 0.15g、烟酰胺 1g、维生素B6 0.02g、淀粉3.08g、糊精0.96g、磷酸氢钙2g、95%乙醇0.9g、羟甲基淀粉钠0.3g和硬脂酸镁0.06g于研钵中，研细，精密称取适量(约相当于供试品3.4片量)，于50mL量瓶中，加流动相35mL，按供试品溶液制备方法处理，取滤液待测。在被检测成分的出峰时间内对测定不存在干扰。

3.3 检出限与定量限测定结果

以信噪比(S/N)=3时为检出限，以(S/N)=10为定量限，测得烟酸的检出限及定量限为0.2ng/mL和0.5ng/mL。

3.4 线性与范围

精密称取烟酸对照品(批号：100434-201102)17mg，置50mL量瓶中，加水适量，按烟酸测定项下同法处理。精密量取上述对照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL注入色谱仪，记录色谱图；以浓度为横坐标(μg/mL),以相对应的峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归。烟酸线性方程为：Y=34308-778.92(n=7 r=0.9996)。结果表明烟酸在0～4.3μg/mL浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

3.5 精密度试验

照烟酸测定项下同法处理烟酸对照品溶液(批号：100434-201102)1份，连续进样6次测定，烟酸峰面积精密度RSD小于2%，说明仪器精密度良好。

3.6 稳定性试验

照烟酸测定项下同法处理对照品溶液(批号：100434-201102)一份，分别于0h、6h、12h、24h、36h、48h进行测定，烟酸峰面积精密度RSD小于2%，结果表明烟酸在48小时内性质稳定。

3.7 耐用性试验

其他色谱条件不变，改变流速为0.7mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min；改变流动相pH值分别为6.3、6.5、6.8；改变柱温：20℃、30℃、35℃；改变色谱柱型号为UITimatexb-C18(5μm 4.6×250mm)、Kromasil (5μm 4.6×250mm)、CAPCELL PAK MG(4.6mm×150mm,5μm)。依法测定，结果显示，各杂质峰保留时间有所改变，但分离度良好，说明该方法耐用性良好。

3.8 样品测定

取13个厂家的烟酰胺原料药、每个厂家各3批共计39批复合维生素B片，各精密称取适量(约相当于烟酰胺34mg)，照供试品溶液处理，取烟酸对照品按对照品溶液处理，按拟定的色谱条件与测定方法进行测定,13批原料药中7批可检出烟酸，39批制剂均能检出烟酸。

表1 13个厂家复合维生素B片烟酸的检测结果

4 讨论

4.1 TLC法与HPLC法杂质检出结果的比较

因受检出限的限制，供试品中均未检出烟酸及其他杂质，未能有效考察样品间杂质差异，对样品的内在质量控制不利。采用新建的HPLC法均能检出烟酸，能高效、快捷地区分样品间杂质量的差异并进行定量。