氨基酸分析仪法快速检测土鳖虫中谷氨酸含量

张华丽，周洪亮 ，孙家昌

(1.济宁医学院 山东省出生缺陷研究与转化协同创新中心，山东 济宁 272067； 2.济宁市妇幼保健计划生育服务中心，山东 济宁 272000)

土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖 (EupolyphagasinensisWalker)或冀地鳖(Steleophagaplancyia(Boleny))的雌虫干燥体[1]，又称土鳖、簸箕虫、地鳖虫、地乌龟、土元等[2]。土鳖虫在我国《神农本草经》等各种古代医药学典籍中均有详细记载，其性寒味咸，有活血散瘀、消肿止痛、接骨连筋之功效，可用于淤血症、跌打损伤、慢性肝炎等[3-4]。现代药理学研究证明，土鳖虫有抗凝血和抗血栓、肝脏保护[5]、提高免疫力[6]、抗氧化、抗衰老[7]、抗肿瘤[8-9]、促进骨骼愈合[10]等作用，作为传统的药食两用资源，具有良好的开发前景。

土鳖虫中富含多种氨基酸，总质量分数占虫体的40%[11-13]，其游离和水解氨基酸包含了17种以上主要氨基酸，其中7种是人体所必需的氨基酸，占其氨基酸总量的30%以上[14]，其中以谷氨酸、丙氨酸及酪氨酸含量最高，在活血化瘀、消肿止痛、抗氧化等方面发挥着重要的药理作用[15-16]。近年来对土鳖虫中氨基酸的研究主要集中在药理活性方面，如何准确并快速地检测土鳖虫中的氨基酸含量，对其质量控制及开发应用具有重要的现实意义。

氨基酸含量测定方法较多，包括可见分光光度法[17]、气质联用仪技术[18]、柱前衍生化高效液相色谱法和氨基酸自动分析仪法[19]等。可见分光光度法只能测定总氨基酸含量，气质联用仪技术前处理步骤复杂，柱前衍生化高效液相色谱法存在衍生化试剂不稳定、衍生化反应受溶液pH影响大等缺点。而氨基酸分析仪法有选择性、专属性强，灵敏度高，检测速度快等优点，操作简便，适用于多种组分中单一组分的快速检测分析，因而本研究以谷氨酸为指标性成分，采用氨基酸自动分析仪，优化土鳖虫中谷氨酸的提取检测方法，为其质量控制及资源深入开发提供技术支持。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

DFT-200手提式小型粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)；L-8900氨基酸分析仪(日立公司)；SHZ-DIII循环水真空泵(郑州予华仪器制造有限公司)；204E/02电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；GZX-9023MBZ电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)。

1.2 实验材料

谷氨酸标准液(日本和光纯药株式会社)；盐酸溶液(莱阳经济开发区精细化工厂)；重蒸水(自制)。土鳖虫购自中药店(10批次样品产地见表1)，60 ℃干燥至恒重，粉碎，过40目筛，细粉备用。

表1 土鳖虫样品来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取土鳖虫粉末50 mg，将其粉碎，置于安瓿内，加入6 mol/L的盐酸20 mL密封，恒温100 ℃水解22 h，将水解产物置于蒸发皿中蒸干，加入7～8 mL蒸馏水，再蒸干，重复3次。加入0.2 g活性炭脱色，过滤水洗至澄清。稀释至50 mL 后，用氨基酸自动分析仪测定含量。

2.2 对照品溶液的制备

取谷氨酸标准液(2.5 μmol/mL)2 mL稀释至50 mL，作为标样对照液(0.1 μmol/mL)。

2.3 标准曲线的绘制

精密移取谷氨酸标准液(2.5 μmol/mL)10、15、30、60、120 μL于5个样品管中，稀释至1200 μL，配置成浓度分别为0.020 83、0.031 25、0.062 50、0.125 0、0.250 0 μmol/mL的标准溶液。氨基酸分析仪自动依次进样，进样量为20 μL。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做回归曲线，得回归方程为Y=29 999 644X+84 962,R2=0.999 9，线性关系良好。

2.4 盐酸浓度对氨基酸提取的影响

精密称取4份过40目筛的土鳖虫细粉各50 mg，置于试管中，分别加入1、2、4、6、8 mol/L 的盐酸溶液20 mL，恒温100 ℃水解22 h，按2.1项下方法处理。稀释至50 mL后用氨基酸自动分析仪检测，结果见图1，横坐标为盐酸浓度cHCl，纵坐标为谷氨酸提取量m。由图1可知，当盐酸浓度为6 mol/L时提取率达到最高。

图1 盐酸浓度对谷氨酸提取量的影响Fig.1 Effect of HCl concentration on glutamic acid extraction

2.5 料液比对土鳖虫氨基酸提取的影响

2.6 提取时间对土鳖虫氨基酸提取的影响

精密称取4份过40目筛的土鳖虫细粉各50 mg，置于试管中，分别加入6 mol/L的盐酸溶液20 mL，密封，在100 ℃恒温条件下，分别提取14、18、22、26 h，然后按2.1项下方法处理。稀释至50 mL后用氨基酸自动分析仪定量分析，结果见图3，横坐标为提取时间，纵坐标为谷氨酸提取量m。由图3可知，土鳖虫中谷氨酸的提取时间22 h为宜。

图3 提取时间对谷氨酸提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on glutamic acid extraction

2.7 精密度试验

取2.2中浓度为0.1 μmol/mL的谷氨酸标样对照液重复进样6次，每次20 μL，分析精密度试验结果,见表2，得到相对标准偏差(RSD)为0.24%(n=6)，说明该仪器的性能良好，误差较小，适用于快速分析。

表2 精密度试验

2.8 重复性试验

精密称取同一批次的土鳖虫粉末样品6份，按照2.1项下的方法配置溶液并进行含量测定，结果见表3，计算RSD为3.18%，表明本法重复性较好。

表3 重复性试验

2.9 加样回收率试验

表4 回收率试验

2.10 稳定性试验

取样品按2.1制备供试品溶液，按2.8条件在0、2、4、6、8 h后进行测定，分析结果见表5，由数据可知此方法稳定性良好。

表5 稳定性试验

2.11 谷氨酸质量分数测定

采用建立的方法对不同产地和批次的土鳖虫样品进行分析，测定谷氨酸含量，结果见表6。不同地区土鳖虫中谷氨酸含量存在较明显差异，含量范围为72.61～78.12 μmol/g，换算为质量分数(w)即1.068%～1.149% ，其中浙江、山东样品谷氨酸含量较高，云南、广西样品含量较低。

表6 10批次土鳖虫氨基酸含量的测定结果

3 讨论

3.1 盐酸浓度对氨基酸提取量的影响

由图1可知，谷氨酸提取量随盐酸浓度的增加呈先上升后下降的趋势，变化幅度较大，当盐酸浓度为6 mol/L时提取率达到最高。随着盐酸浓度增加，蛋白质的水解程度增加，氨基酸的提取率增加，而盐酸浓度过高时，过量的盐酸可破坏氨基酸的结构，从而导致氨基酸的提取率下降。结果表明，6 mol/L的盐酸浓度有利于土鳖虫中谷氨酸的提取，同时又可节省溶剂用量和生产成本。

3.2 料液比对土鳖虫氨基酸提取的影响

3.3 提取时间对土鳖虫氨基酸提取的影响

由图3可知，随着提取时间的增加，土鳖虫中谷氨酸的提取量逐渐增大，当时间为22 h时提取量最大，之后提取量有所降低，推测可能是由于经过一定时间的提取，蛋白质已充分消解，继续延长提取时间会破坏氨基酸的结构，提取量无法增加反而因长时间的作用而逐渐降低，故选时间22 h为宜。

4 结论