中红外光谱技术对临泽小枣中多糖的定量分析

于喆源，杨玺文*，王晓霞，冯颖，梁磊

甘肃省张掖市质量检验检测研究院（张掖 734000）

中国有非常长的栽培枣的历史，黄河流域一带是其主要产地，也被认为是中国比较特有的一个果树资源[1]。临泽小枣（Linze jujube）主产甘肃省张掖市临泽县和甘州区，具有1 400多年的种植栽培历史，2008年临泽小枣通过了国家质量监督检验检疫总局组织的专家审查会的评审，获得了国家地理标志产品保护，是我国著名的加工型优质枣品种之一[2]。多糖作为临泽小枣一种主要成分，能有效清除人体内氧自由基，具有提高机体免疫力的生理活性，在天然食品及药品方面有着广泛的应用前景[3-4]。目前，枣中多糖的测定方法主要以传统可见光-紫外分光光度法为主，在实际操作过程中存在周期长、操作复杂、需要消耗大量的化学试剂等缺点，且容易产生偶然误差，难以实现准确快速经济的目标。

红外光谱技术是近些年发展起来的一种现代分析新技术，因其分析快速、操作简单、不需要任何化学试剂、对样品无损伤等特点，已经在诸多领域发挥出重要的作用[5-6]。其中，中红外光谱（MIR）可以依据化合物基团振动峰，快速鉴别其结构信息，进而结合化学计量学方法构建相关定量模型，克服近红外光谱灵敏度低、无法直观给出特征基团信息等缺点，其灵敏度相比近红外光谱会有明显提高[7]。

因此基于中红外漫反射光谱技术，结合化学计量学方法以及多种波谱预处理方法，建立临泽小枣中多糖的定量检测模型，实现对临泽小枣多糖的快速检测，为进一步建立全面的临泽小枣质量评价体系和扩大市场潜力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用到的36批临泽小枣样品采集自甘肃张掖临泽小枣主要产区和成规模引种区域，经甘肃张掖市质量检验检测研究院药品检验中心杨玺文工程师鉴定为鼠李科枣属植物枣（Jujube）的干燥成熟果实。在采集样品之后将其放置于阴凉的位置，采取自然保存的方式逐步晾干，在60 ℃下进行24 h的干燥处理，然后将其粉碎，以粒径0.075 mm的规格进行过筛处理，再封袋以备后续使用。

D-葡萄糖（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪器与设备

IRSPirit傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司）；GL224i-1SCN万分之一电子天平（赛多利斯上海贸易有限公司）；GL323-2SCN千分之一电子天平（赛多利斯上海贸易有限公司）；HH-4恒温水浴锅（上海汗诺仪器有限公司）；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 红枣多糖的测定

红枣多糖的测定，参考相关学者的优化后方法[8-9]。精密称取1 g样品，采用石油醚除去脂，80%乙醇除去可溶性糖后水提多糖，精密最终定容体积50 mL，按《中华人民共和国药典》（2015年版）第一部正文“枸杞子”下“多糖含量”项，以葡萄糖为标准品，采用硫酸苯酚法，吸取0.2 mL样品提取液，依法测定[10]。

1.3.2 红外光谱的采集

利用IRSPirit傅里叶变换红外光谱仪配备的漫反射附件采集样品光谱。红外光谱测定范围7 900～400cm-1，扫描次数20次，分辨率4 cm-1，测量环境的湿度小于30%，温度保持在25 ℃。以环境空气作为背景，光谱数据以log（1/R）形式表示。

1.3.3 模型的建立

采用TQ Analyst光谱分析软件对所得的红外光谱进行预处理及模型的构建。选取24个样品作为校正集，其余12个样品作为验证集，分别采用PLS、PCR、CLS和SMLR 4种方式进行定量建模。波谱的预处理工作主要通过二阶导数（SD）方法、一阶导数（FD）方法、多元散射校正（MSC）方法以及矢量标准归一化（SNV）方法，然后进行效果的比较，以进一步优化相关的模型。所采用的验证指标包括预测均方差（RMSEP），校正均方差（RMSEC）以及校正相关系数（R）等。模型的效果越好，R越接近1，而RMSECRMSEP的值越小[11]。

1.3.4 模型验证

对建好的模型进行评估，取12个验证集进行模型拟合，查看独立验证集各样品中模型预测多糖含量是否与实测多糖含量相符，如相符则证明模型良好。偏差越小，说明模型预测效果越好。

2 结果与分析

2.1 多糖含量

采用随机的方法来分配临泽小枣样品（总数共计36个），形成所需的验证集与校正集，二者比例为1：2。具体样品多糖含量分布见表1。由36个临泽小枣样品多糖含量的测定可以发现，所得的多糖含量数据中具有比较大的变化范围，其中的最小及最大值都处于校正集之中，校正集和验证集具有比较相近的均值。

表1 校正集和验证集样品含量分布

2.2 临泽小枣中外光谱分析及建模方法的确立

多糖通常指10个以上单糖分子通过糖苷键连在一起的长链聚合物，各样品的中红外漫反射光谱如图1所示。可以看出，临泽小枣样品的红外吸收峰主要集中在4 000～400 cm-1波数范围内，因此在后续的建模过程中以4 000～400 cm-1作为建模的全波段。3 600 cm-1处为—OH的伸缩吸收段，3 100～2 800 cm-1处有较强的吸收峰，D-葡萄糖C==O伸缩振动峰的位置处于1 600 cm-1周围，而α-(1, 4)-糖苷键所对应的伸缩振动位置则处于 930 cm-1附近，处于1 100 cm-1周围区域的通常为多糖O—H与C—C弯曲振动以及C—O伸缩振动所分别对应的峰[12-13]。

基于临泽小枣的红外波谱特性，分别用PLS、PCR、CLS和SMLR构建其多糖定量模型。各模型相应的稳定性如表2所示。可以看出，与PCR、CLS、SMLR相比，基于PLS构建的多糖定量模型效果最优，其相关系数R为0.951 8，校正集（RMESC）为2.87，验证集（RMSEP）为3.51。因此，选用PLS作为构建临泽小枣多糖中红外定量模型的建模方法。

图1 36批临泽小枣的中红外漫反射光谱图

表2 4种化学计量学方法对多糖定量模型稳定性的影响

2.3 光谱预处理方法的选择

在采集红外光谱的相关信息过程中，所提取的有效信息将会受到一系列因素的影响，包括背景、散射光以及噪声等方面，从而引起红外光谱基线出现一定的漂移现象，所以有必要预处理原始的光谱信息。采用多元散射校正方法（MSC）可将漫反射所致光谱不重复性和镜面反射等现象予以显著的消除；而采用矢量标准归一化的方法（SNV）则可使样品不均匀所引起的各类噪声予以有效的消除，此外还能够消除光程变换的影响和散射作用等；导数处理可消除基线漂移、背景干扰并且忽略谱线重叠，主要用于基线校正与提高光谱分辨率[14-16]。当前的研究工作对比了MSC，SNV，FD以及SD等预处理过程所获得的结果，具体如表3所示。

表3 不同预处理方法对定量模型性能的影响

比较发现，采用FD+MSC对光谱进行预处理时，R2最大，RMSECV和RMSEP最小。因此，最终确定FD+MSC为试验最佳预处理方法，结果见图2。

图2 临泽小枣多糖含量的MIR模型预测值与参考值相关图

2.4 多糖定量模型的验证

在多糖定量分析模型中导入了验证集样品（其数量共计12个）的红外图谱数据，进行多糖含量的预测，MIR预测值与真实值比较见表4，偏差图见图3。可以发现，所得结果和预测数据十分接近，绝对误差范围为-2.94～5.23，相对误差范围为2.79%～5.05%，说明建模效果较好，所建立的模型预测结果较为准确，其预测的准确率较高，能够满足临泽小枣关于多糖含量快速检测任务。

表4 12份验证集样品的真实值和预测值

图3 临泽小枣多糖含量的MIR预测值与参考值的偏差图

3 结论

试验基于中红外漫反射光谱技术，采用现行主流分光光度法测定临泽小枣中多糖含量，并与其光谱对应，通过对比不同建模方式和光谱预处理方法处理后的结果，最终采用PLS方式，光谱预处理采用一阶导数+多元散射校正，建立临泽小枣中多糖含量模型。所建立的模型R2为0.965 5，RMSEC为2.71，RESEP为2.93。建立的模型效果较好，可用于临泽小枣中多糖快速定量，达到快速、无损检测的目的。研究所建立的基于中红外漫反射光谱技术对临泽小枣中多糖快速定量的方法，具有操作简单、检测效率高，不耗费试剂等优点，可为临泽小枣的质量控制和进一步开发潜在价值奠定一定基础。

此次用于建模的临泽小枣样品数量为36批，覆盖其主要产地甘肃张掖临泽县各个种植乡镇以及甘肃酒泉玉门市引种地区，但对其他地域引种样本几乎没有涉及。在今后的研究中，将进一步扩大样本数量，广泛收集其他引种地域样本，优化模型，以期使模型更具有实际应用价值。