荧光PCR检测高血压用药相关基因多态性方法的建立

刘秀卿 李延武 黄磊

药物代谢的遗传差异和药物作用靶点如受体的遗传多态性是影响个体对药物反应的主要因素。已明确与高血压药物治疗显著相关的基因主要包括CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE等药物代谢酶及其受体［1-4］。其中在中国人群中有多态性意义的基因突变，包括CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）等［5-7］。目前高血压用药基因检测主要有四种方法：测序、PCR-RFLP、基因芯片和PCR-熔解曲线。前三者操作繁琐，费时费力，难以满足临床常规检测需求，而PCR-熔解曲线的特异性及结果判断的简易程度不及荧光PCR。荧光PCR 具有高灵敏性、高特异性、操作简便、结果判断简单等特点，便于临床常规检测。本研究旨在建立一种简单、准确的荧光PCR 法，检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）位点的多态性，为高血压药物临床使用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

收集2017年6月至2019年1月本院EDTA-K2抗凝全血样本362 份（含高血压93 例）。纳入标准：已完成高血压基因芯片检测的住院患者。排除标准：①既往有精神病、血液病、肿瘤病史患者；②无法完成检测的样本；③所有患者彼此无亲缘关系。经深圳市第二人民医院伦理委员会批准，使用已完成检测的剩余样本，故豁免知情同意。

1.1.2 试剂和主要仪器

深圳菲鹏10×Taq buffer（Mg2+plus）、25 mmol/L dNTP（含dUTP）、HS-Taq Ex（5 U/μL）、UNG 酶、江苏康为世纪核酸提取试剂（50326）、湖南宏灏高血压基因芯片检测试剂（201811001）；深圳亚能YN-16 杂交仪、美国美谷Genepix 4100A 生物芯片扫描仪、杭州博日FQD-96A 荧光PCR 仪、德国Implen P-330-31 超微量分光光度计。

1.2 方法

提取标本DNA 置-70℃冰箱保存待用。引物探针设计 用Primer Premier 5.0 及Primer Express 3.0 软件设计引物和探针组。见表1。

表1 引物和探针Table 1 Primers and probes

PCR 扩增产物送至赛默飞世尔科技广州测序中心进行双向序列测定。基因芯片检测操作参照仪器和试剂说明书。

荧光PCR反应：分5管进行。反应体系20 μL，包括Taq Buffer 2 μL，HS-Taq Ex 0.2 μL，UNG 酶0.05 μL，dNTP2 μL，10 μmol/L 引物对及探针各0.2 μL；DNA 1.5 μL，ddH2O 13.45 μL。循环参数：37℃10 min；95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，共40 个循环，在延伸阶段60℃收集荧光信号。见表2。

表2 荧光PCR 结果判读Table 2 Results interpretation of fluorescence PCR

性能评价：检出限：将各位点H 型、W 型、M 型的核酸用TE 缓冲液分别稀释至50、30、20、10 和5 ng/μL，用荧光PCR 检测3 次，型别正确即符合。重复性：稀释至20 ng/μL 分3 批检测，每批检测8次，计算FAM 和VIC 通道Ct 平均值、标准差和变异系数，CV<5%为合格。抗干扰能力：分别加入3 200 mg/dL 甘油三酯、200 g/dL 血红蛋白、150 mg/dL 胆红素、2 倍治疗浓度的高血压常用药物，共90 个样本。提取后检测。临床样本检测及准确度：用三种方法分别检测362 例样本。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 数据分析；采用四格表分析，与基因芯片法相比，评价荧光PCR 法的符合率、特异性并进行配对卡方检验；与测序法相比，评价荧光PCR 法的符合率、准确性并进行配对卡方检验；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检出限

结果显示20 ng/μL 的样本3 次检测均型别正确。CYP2C9*35 ng/μL 和ADRB1（1165G>C）10 ng/μL H 型样本FAM 通道均只有2 次有扩增；ACE（I/D）10 ng/μL H 型样本FAM 和VIC 通道都只有2 次有扩增。见图1。

图1 荧光PCR 检测结果Figure 1 The results real-time PCR

2.2 重复性

H 型、W 型、M 型批内差及批间差均小于5%。见表3。

表3 重复性检测结果（%）Table 3 Repeatability test results（%）

2.3 抗干扰能力

所有加入干扰物质的样本检测CT 值与原始样本CT 值的差值均在1 个CT 值以内。见表4。

表4 抗干扰能力检测结果Table 4 Test results of anti-interference ability

2.4 临床样本验证与准确性

其中有5 例CYP2D6*10荧光PCR 为W 型而基因芯片为H 型，另各1 例荧光PCR 为H 型和M型而基因芯片为M 型和H 型；还有3 例ACE（I/D）荧光PCR 为W 型而基因芯片为H 型；荧光PCR 基因分型与测序结果完全一致，符合率100%，见表5。各位点测序图见图2。362 例样本分高血压和非高血压组，基因型分布。见表6。

表5 3 种检测方法检测结果对比分析Table 5 Comparative Analysis of the results of three detection methods

表6 高血压组和非高血压组各基因分布Table 6 Distribution of genes in hypertension group and non hypertension group

3 讨论

CYP2D6*10多态性可影响美托洛尔、卡维地洛等药物在体内的代谢过程［8］；CYP2C9*3能降低依贝沙坦、甲苯磺丁脲等药物的体内清除率［1］；ADRB1是β1 肾上腺素受体类药物的作用靶点，会影响药物疗效；AGTR1（1166A>C）能影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂类药物的疗效［9］；ACE（I/D）能影响ACE 抑制剂和β 受体拮抗剂类药物的效应［10-11］。基因检测能让医生了解患者对不同降压药物的疗效反应及毒性，更好地进行个性化治疗。因此临床急需建立一种快速简便可以联合检测高血压用药相关基因的方法。

荧光PCR 法对362 例临床样本进行检测，总体CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）的基因型分布与张欣然等人的文献报道一致［12］；而CYP2D6*10和ACE（I/D）的基因型分布与赵杰娉等人的报道不太一致［13］，这与选取特定样本的分组有关。本实验结果与李俊萍［14］等对石家庄汉族人群的ADRB1基因多态性研究结果相一致，这提示ADRB1基因中C 等位基因有可能是高血压的易感基因。

荧光PCR 检测CYP2C9*3、ADRB1 和AGTR1与基因芯片100%符合，CYP2D6*10、ACE的基因型符合率分别是98.07%、99.17%，检测结果无统计学差异。以Sanger 测序为金标准，荧光PCR 法的准确性、特异性、敏感性均为100%，证实了荧光PCR 法的准确性高于基因芯片法。准确荧光定点、合理调节芯片亮度与对比度以及正确设立判定参数，均会影响基因芯片结果判定。此外，ACE 3 例插入型基因芯片为杂合型，可能由于插入型和缺失型有一段高度相似的序列导致；CYP2D6*10有7 例基因芯片与测序不一致，也可能CYP2D6*1/*10存在小概率突变［15］。荧光PCR 亦证实CYP2D6杂合子分型中C∶T 存在1∶1、1∶2、1∶3 的现象，但VIC 信号值不会低于FAM 1/2。无论是Sanger 测序、基因芯片还是荧光PCR，前期处理大致相同，前二者需后处理费时费力，而荧光PCR 操作简单、准确率高、特异性强、重复性好、省时快速且结果判读容易，能更好的服务病人与临床。当然荧光PCR 也有局限性，只可检测已知的SNP 位点而不能发现未知的SNP 位点［16］。

综上所述，荧光PCR 法能够快速准确对患者高血压相关的功能意义明确且发生频率较高的基因突变进行分型，如果能够扩大样本量并且进行多中心临床验证，它将具有广阔的应用前景。

图2 测序结果Figure 2 Sequencing results