MGMT、h MLH1基因在人脑胶质瘤中的表达及对常见药物化疗敏感性的影响研究

王传玺 梅洁 闫兆月 张凤平 段冉 丁艮晓

人脑胶质细胞瘤［又简称“脑胶质瘤”（glio-ma），后文均用简称］在所有颅内病变、颅内恶性肿瘤中占比约为45%、80%［1］。洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺等一线化疗药物在临床脑胶质瘤治疗中几乎必不可少，具有生物利用度较高、易透过血脑屏障、毒副反应风险低等优势。然而实际临床中部分患者化疗疗效难以尽如人意，孙琳［2］等研究显示脑胶质瘤患者经替莫唑胺化疗药物获得有效率仅为34%，重要影响因素即化疗药物耐药。脑胶质瘤耐药机制复杂，当前认为可能与多种基因有关，进一步探索肿瘤组织中相关耐药基因表达水平对肿瘤恶性程度判断、化疗敏感性评价及指导针对性治疗有一定现实意义。O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase，MGMT）、错配修复基因（Human mutl homolog 1，h MLH1）近年来因已被证实与胃肠道肿瘤、肺癌、乳腺癌等化疗耐药有关而引起了临床学者广泛重视［3-5］。本研究旨在分析这两者基因在人脑胶质瘤中的表达及对常见药物化疗敏感性的影响。

1 标本与方法

1.1 标本来源

于2017年6月至2020年10月，收集本院行开颅手术切除的80 例胶质瘤石蜡切片标本，对应患者术后经细胞学或组织病理学获得胶质瘤明确诊断［6］；≥18 岁；术前未接受化疗等其他相关治疗；标本对应病例资料信息完善。男女比例为3∶2；平均年龄（47.55±10.71）岁；病理类型含有39 例（48.75%）星形细胞瘤、19 例（23.75%）室管膜瘤、15例（18.75%）少突胶质细胞瘤与7 例（8.75%）胶质母细胞瘤；世界卫生组织胶质瘤病理分级［7］含有25 例（31.25%）为Ⅱ级、35 例（43.75%）为Ⅲ级、20例（25.00%）为Ⅳ级。同一时期抽取40 例患者经脑外伤减压切除的脑组织切片标本，明确为正常脑组织，男女比例为3∶2；平均年龄（49.07±11.60）岁，与脑胶质瘤标本对应患者的性别比例、年龄相比差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者及家属均知情同意。本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 MGMT 与h MLH1 蛋白免疫组化检测

脑胶质瘤、正常脑组织标本蜡块进行修整后，调整位置连续切割3～4 μm 切片，放载玻片烘烤、100%乙醇中脱水后梯度水化，冲洗后放于含抗原修复液的高压锅中持续加热，之后于室温冷却完成抗原修复。随后室温下封闭孵育，PBS 反复洗涤后即可加入对应抗体（一抗，其中鼠抗人MGMT抗体、兔抗人h MLH1 抗体均购买于美国Abcam公司），4℃冰箱过夜孵育后予以PBS 液再次反复冲洗后即可给予二抗，之后室温继续孵育，PBS 液反复冲洗后依次完成DAB 与H2O2显色液配制、复染、二甲苯浸泡透明、中性树脂封片、光学显微镜下阅片等操作。

1.2.2 结果判读［8］

随机择取5 个高倍显微镜（400×）视野，观察阳性细胞对应染色强度及所占百分比，基于二者的乘积完成最终评分；阳性细胞无着色、着浅黄色、着棕黄色、着棕褐色依次记为0 分、1 分、2 分、3 分，阳性细胞所占百分比<5%、≥5%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%及≥75%依次记为0分、1 分、2 分、3 分、4 分；最终评分0 分为阴性（-），1～4、5～8、9～12 分均视为为阳性，分别为（+）、（++）及（+++）。

1.2.3 敏感性试验

标本除菌洗涤液：含双抗的无血清RPMI-1640培养液，青霉素与链霉索浓度为100 μ/mL；组织培养液：含10%小牛血清的RPMI-1640 培养液，噻唑蓝溶液浓度为10 mg/mL，通过生理盐水配制及除菌处理后备用，4 摄氏度环境避光保存。化疗药物及其对应浓度：洛莫司汀、福莫司汀均为10 μg/mL，替尼泊苷20 pμg/mL，尼莫司汀6.5 pug/mL 及替莫唑胺7 μg/mL。所用药物浓度均参考说明书所给血浆峰浓度，选用灭菌注射用水作为配药溶剂。组织培养药敏采用组织块培养-终点染色-计算机分析法（tissue culture-end point staining com-puter image analysis，TECIA），组织培养为四孔同步法，可保证组织块存活及培养成功，即四孔培养基中平均有3 孔以上存活。参照文献［9］方法计算化疗药物抑制率（IR），药物敏感性以IR 作为评价标准，IR>50%为敏感，30%～50%为中度敏感，<30%为耐药。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据处理，计数资料用n（%）描述，行χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同脑组织MGMT 与h MLH1 基因表达情况

脑胶质瘤、正常脑组织中MGMT 与h MLH1基因表达程度差异比较均有统计学意义（P<0.05）。见表1。MGMT 与h MLH1 均在细胞核呈现棕黄色颗粒或阳性显色弥散分布。见图1。

表1 MGMT、h MLH1 表达比较［n（%）］Table 1 expression comparison of MGMT and h-mlh1［n（%）］

图1 MGMT、h MLH1 基因在脑胶质瘤、正常脑组织中表达（SP，×400）Figure 1 expression of MGMT and H MLH1 genes in glioma and normal brain tissues（SP，×400）

2.2 不同病理类型、分级脑胶质瘤组织MGMT 与h MLH1 基因表达情况

不同病理类型脑胶质瘤组织脑胶质瘤组织中MGMT 与h MLH1 基因阳性表达率均无统计学意义（P>0.05），而病理分级Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中MGMT 与h MLH1 基因阳性表达率依次升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 不同病理、分级类型脑胶质瘤组织MGMT 与h MLH1 基因表达比较［n（%）］Table 2 Comparison of MGMT and hMLH1 gene expression in different pathological and grading types of gliomas［n（%）］

2.3 化疗敏感性与病理特征及MGMT、h MLH1基因免疫组化因子表达强度的关系

莫司汀、替尼泊苷、替莫唑胺敏感率与病理分级有关（P<0.05），MGMT、h MLH1 阳性表达洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺敏感率均明显低于阴性表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 化疗敏感性与病理特征及MGMT、h MLH1 基因表达强度的关系［n（%）］Table 3 The relationship between chemosensitivity and pathological features and the expression of MGMT and hMLH1 genes［n（%）］

3 讨论

本研究发现MGMT、h MLH1 两种基因在对应脑组织标本中均在细胞核呈现棕黄色颗粒或阳性显色弥散分布，而且MGMT 和h MLH1 基因在人脑胶质瘤标本中阳性表达率高，与Deimling［9］等及李孟凯［10］等早期报道结果一致；同时，MGMT 和h MLH1 基因表达与脑胶质瘤病理类型无关，与疾病进展有一定关联。其中MGMT 作为一种DNA修复酶，具有修复经亚硝脲类化疗药物引起的DNA 烷基化损害作用，可直接影响脑胶质瘤化疗效果甚至促使化疗失败，最终导致肿瘤进展。Wen［11］等报道证实脑胶质瘤组织MGMT 基因表达异常升高，且与病理分级及预后密切相关。事实上，h MLH1 基因为h MLH 中重要的一员，在DNA错配修复功能缺陷中扮演了举足轻重的角色，被视为包括脑胶质瘤在内的多种肿瘤的诊断特异性指标，王磊［12］等报道即曾证实h MLH1 基因表达与结肠癌发生及进展有关。

本研究中除了病理分级可影响人脑胶质瘤部分药物化疗敏感性以外，MGMT 和h MLH1 基因可影响多种药物化疗敏感性，包括洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺，即MGMT、h MLH1 表达程度与化疗敏性密切相关。由于MGMT 能够修复以烷化剂为代表的抗肿瘤药物引起的细胞损伤，因此可通过肿瘤组织中表达水平反映对烷化剂如洛莫司汀、替莫唑胺等的敏感性［13］。Holmes［14］等学者发现，MGMT 高表达的肿瘤细胞对烷化剂抗癌药耐药性比低表达更显著，认为下调表达阳性或高表达胶质瘤中MGMT 表达对于提高替莫唑胺等一线药物化疗效果有助益。需指出的是，碱基错配修复系统与MCMT 被视为脑胶质瘤一线药物产生耐药的最重要的两个因素，其中前者作为修复DNA 碱基错配的安全保障体系，包括多个hMLH 基因，均能够识别并清楚错误或异常配对的胸腺嘧啶，倘若该体系甲基化或突变，极易导致DNA 错配修复功能缺陷，继而影响药物敏感性，而h MLH1 正是错配修复基因最重要成员之一，极易发生甲基化，并引发错配修复系统失活［15］。刘容容［16］等证实了h MLH1 基因阳性表达可影响替莫唑胺化疗敏感性，也认为可能机制为h MLH1 基因启动子甲基化增强。上述均说明MGMT、h MLH1 基因与脑胶质瘤治疗过程药物敏感性有关，支持了本研究结论，故推测以上两个基因对改善脑胶质瘤化疗耐药性有一定指导作用，即通过降低MGMT、hMLH 表达可能能够降低恶性脑胶质瘤对相关药物的耐药性，增强化疗敏感性，但其具体实践效果有待研究证实。此外，MGMT 和h MLH1 基因影响多种化疗药物敏感性的原因还可能为二者均参与促进脑胶质瘤细胞侵袭，但其具体机制有待后续研究论证。