热处理对葵花分离蛋白结构特性的影响

孙天颖，程红，陈珂玥，任健*

(1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省玉米主食工业化工程技术研究中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

葵花蛋白具有较好的吸水吸油性、盐溶性、起泡性和乳化性等性质，将其作为添加剂加到香肠类制品中可有效防止脂肪成分的析出，并且在熏制和蒸煮过程中减轻收缩现象。葵花蛋白可使午餐肉的弹性、硬度得到改善。葵花酱作为食品调味料广泛使用，葵花蛋白水解物也可以做成食品调味料的基料。因此，葵花蛋白是食品工业理想的添加剂[1]。

热处理是食品加工过程中常用的一种加工手段，热处理也是影响蛋白质结构和功能的主要因素之一，蛋白质结构随着热处理条件的改变而发生变化，势必导致蛋白质相应的功能特性也随之发生变化[2]。本课题组之前探讨了热处理对葵花分离蛋白和葵花11S球蛋白的持水持油性、溶解性等功能性质的影响[3]，本研究将进一步讨论热处理对葵花分离蛋白的氨基酸组成、二级结构、粒径分布、表面形态等结构性质的影响，探索葵花分离蛋白结构与其功能性的关系，为葵花蛋白在食品工业中的应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葵花籽分离蛋白：实验室制备；胰蛋白酶：诺维信公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要设备仪器

L-8900型全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；Q-20型差式扫描量热仪(DSC) 美国TA公司； J-815型圆二色谱(CD)仪 日本JASCO公司；TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；BT-9300H型激光粒度分布仪 丹东百特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葵花分离蛋白的制备

将葵花籽粉碎后用石油醚提取4次，每次3 h，常温干燥，粉碎后过60目筛，再采用盐溶酸沉制得葵花分离蛋白[4]。

1.3.2 葵花分离蛋白的热处理

葵花分离蛋白的热变性温度为102 ℃左右，分别选择92，102，112 ℃对葵花分离蛋白进行热处理。将20 mL浓度为8%(V/V)、pH 7.0的蛋白质溶液置于50 mL锥形瓶中，在水浴92 ℃、油浴102 ℃和112 ℃条件下进行热处理，时间为20 min，冰浴冷却后冷冻干燥。

1.3.3 热处理葵花分离蛋白结构特性分析

1.3.3.1 氨基酸组成分析

称取50～60 mg蛋白质样品置于安瓿管中，加入9 mL 6.67 mol/L的盐酸，充氮后，酒精喷灯封管，在烘箱中酸水解24 h(110 ℃)，加入6 mol/L的氢氧化钠调pH 值至2.2，将其导入100 mL容量瓶中，用柠檬酸钠缓冲液定容，溶液过膜后装入样品瓶中，使用氨基酸分析仪进行分析。

1.3.3.2 圆二色谱(CD)

将浓度为0.15 g/L (pH 8.0)的样品放置于1 mm的比色皿中，采用J-815型圆二色谱(CD)仪开始测试。测试波长为190～240 nm；扫描速度为100 nm/min；带宽为10 nm；数据间距为0.2 nm；反应时间为0.125 s；用平均残基椭圆率表达CD数据。

1.3.3.3 分子柔性的测定

分子柔性的详细测试方法及计算公式见文献[4]。

1.3.3.4 粒径分布

首先将BT-9300H型激光粒度分布仪预热30 min，打开Ver 6.0粒径分析系统，启动超声波和搅拌器清洗粒度仪，待遮光率为0.00%时结束清洗。将不同热处理条件下的葵花分离蛋白加入样品槽中，当软件中正常显示浓度、遮光率在5%以上并且波动范围极小后，开始用软件采集数据。

1.3.3.5 扫描电镜

分别取微量不同热处理条件下的蛋白样品进行电镜扫描，详见文献[4]。

2 结果与讨论

2.1 蛋白样品的氨基酸组成分析

不同热处理条件下蛋白样品的必需氨基酸分析结果见表1。

表1 不同热处理条件下蛋白样品必需氨基酸相对含量

由表1可知，葵花分离蛋白在不同的热处理条件下必需氨基酸相对含量都有所降低，但变化不显著。因为热处理后蛋白质的一级结构氨基酸序列没有显著性改变，热处理改性主要是导致蛋白质的高级结构二、三和四级结构改变，所以反映食品蛋白质营养价值的必需氨基酸总量并没有减少，但它们的吸收性可能会因为蛋白质溶解度的降低而受到一定的影响[5]。

2.2 葵花分离蛋白的二级结构分析

不同热处理条件下葵花分离蛋白的圆二色谱图见图1，热处理后蛋白质溶液中各种结构所占的比例见表2。

图1 不同热处理条件下葵花分离蛋白的圆二色谱图

表2 不同热处理条件下葵花分离蛋白的二级结构

圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质分子构象的一种简单、快速且较准确的方法，由表2可知，热处理对葵花分离蛋白的二级结构具有一定的影响。未经处理的葵花分离蛋白在远紫外区195 nm附近有一个正峰谱带，在远紫外区210 nm附近有一个负峰谱带，表明葵花分离蛋白的二级结构表现呈松散性，主要是β-折叠和无规则卷曲。经92 ℃和102 ℃热处理后，反映蛋白质分子有序性的二级结构α-螺旋含量显著增加，β-折叠结构的含量显著降低后又小幅回升，无规则卷曲结构持续降低，β-转角结构总体小幅升高，表明适当的热处理可使蛋白质由松散的无序二级结构向有序的二级结构转变，这可能是因为氨基酸残基间相互作用形成α-螺旋结构所致。112 ℃热处理后只有松散的β-折叠二级结构含量显著增加，其他二级结构含量都有一定程度的降低，说明剧烈热处理后葵花分离蛋白的二级结构又趋于无序。

2.3 葵花蛋白分子柔性分析

不同热处理温度条件下葵花蛋白分子柔性的检测结果见图2。

图2 不同热处理温度条件下葵花分离蛋白的分子柔性

蛋白质的分子柔性与蛋白质的乳化性和起泡性密切相关，反映了蛋白质的伸展情况，是蛋白质结构变化的重要参数之一。由图2可知，随着热处理温度的升高，葵花蛋白的分子柔性先升高后逐渐降低，92 ℃时分子柔性达到最高，继续升高热处理温度，蛋白质分子发生严重的聚集，分子的刚性增强，分子的柔性下降，且低于葵花分离蛋白[6]，这说明适当热处理可显著提高葵花分离蛋白的分子柔性，主要原因是适当温度条件下的热处理使得蛋白质分子结构伸展、松散，分子柔性增强。

2.4 葵花分离蛋白的粒径分布分析

通过粒径分析可以客观地反映热处理后蛋白质的聚集情况，不同热处理条件下葵花分离蛋白的粒径分布见图3。

图3 不同热处理条件下葵花分离蛋白的粒径分布

由图3可知，热处理对葵花分离蛋白的粒径分布有显著的影响。未被处理过的葵花分离蛋白粒径最小，葵花蛋白的粒径随着热处理温度的上升而增大。蛋白质分子通过热处理能够发生交联或聚集等反应，产生蛋白质聚集物，从而使蛋白质的表观粒径增大。

2.5 葵花分离蛋白的电镜分析

用扫描电镜(EM)可以更直观地观察葵花分离蛋白热处理后表面形态的变化，不同热处理条件下葵花分离蛋白的扫描电镜结果见图4。

图4 不同热处理条件下葵花分离蛋白的电镜结果

由图4扫描电镜结果可以看出，热处理对葵花蛋白的表观形态具有一定程度的影响。未经处理的葵花分离蛋白表面结构紧密，较为光滑。热处理后的葵花分离蛋白表面形态发生了变化，表面结构变得松散且粗糙。随着热处理温度的逐渐升高，其表面的孔隙也增大、增多，导致葵花分离蛋白发生聚集，在这一过程中，较多的蛋白质分子亲水和亲油基团暴露，有利于蛋白质某些功能性质的形成。

3 结论

热处理对葵花分离蛋白的结构特性有一定的影响。葵花分离蛋白经92，102，112 ℃热处理20 min后，蛋白质的二级结构、分子柔性、粒径分布、表面形态等特性发生了变化。热处理可使蛋白质的二级结构变得无序；蛋白质分子之间发生交联或聚集，表面形态变得粗糙，结构变得松散，孔隙增多，粒径增大；适当热处理可使葵花分离蛋白的分子柔性增强。