茶花鸡GDF9 基因多态性与产蛋性状的相关性分析*

张 霞，柳明正，豆腾飞，王 坤，贾俊静，葛长荣

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

转化生长因子-β (TGF-β)是拥有40 多个成员的信号蛋白家族，主要通过附着在细胞膜上的蛋白激酶受体完成信号传导这一复杂的生理过程[1]。GDF9 是该家族的重要成员之一，可激活细胞膜上的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)激酶的受体来调节动物的生长发育[2]。GDF9基因于1993 年首次在小鼠的卵巢中被发现[3]，其翻译的蛋白质由卵泡特异性分泌，通过信号肽合成前体蛋白，进而指导其蛋白二聚化和成熟结构域的形成，当信号肽被切除后，前体蛋白被弗林蛋白酶裂解，分泌二聚体成熟蛋白[4]。GDF9 与BMP15 蛋白可以作为旁分泌因子共同协调颗粒细胞的增殖和分化[5]，在哺乳动物卵巢发育、卵泡形成过程中发挥重要调控作用，促进和调节各种卵泡及卵丘的发育[6]。也有报道表明：GDF9 在卵泡液中能促进卵母细胞核的成熟并显著影响胚胎的质量[7]。GDF9基因在不同物种中定位的染色体不同，如分别位于人的5 号、猪的2 号、牛和山羊的7 号、小鼠的11号以及鸡的13 号染色体，但不同物种间基因结构相似度很高[8]。SMAD、MAPK、PI3K/Akt 和NF-κB 信号通路与TGF-β 家族紧密联系，可影响细胞增殖分化、胚胎发生、个体发育以及脂类糖类代谢等一系列生理、生化过程[8]。通过培养人和小鼠的原代卵巢颗粒细胞，构建GDF9 和BMP15的重组载体研究对抗苗勒氏管激素(AMH) 水平的影响，结果发现：GDF9 和BMP15 的重组载体联合导入细胞才会提高该激素的表达水平，但GDF9 也可单独激活人类卵巢颗粒细胞的Akt 信号通路和小鼠卵巢颗粒细胞的PI3K/Akt 信号通路，说明GDF9基因在该信号通路中扮演重要角色，不仅对雌性动物而且对女性的生殖生育能力也有一定的影响[9-10]。

目前，对于GDF9基因的大部分研究主要集中在人类和哺乳动物，禽类研究相对较少。课题组前期已对云南地方品种茶花鸡的生长性状[11]和肉质性状[12]进行了初步研究，发现其体型矮小、风味甜鲜肉香。作为云南省重要的地方品种，进一步开发利用茶花鸡，并形成一定的规模和产业链具有重要的战略意义。本研究通过探究茶花鸡GDF9基因的多态性位点与产蛋性状的关系以及该基因在繁殖相关组织中的表达情况，为茶花鸡产蛋性状有效分子标记的开发奠定基础，也为茶花鸡的进一步选育提供资料。

1 材料与方法

1.1 试验鸡

选取相同环境条件下饲养的健康且同批次的1 304 羽茶花鸡母鸡作为研究对象，开产后记录每羽茶花鸡的产蛋情况，饲喂到300 日龄时，根据产蛋情况将产蛋数前20% 和后20% 的分为高、低产蛋组，即每组各260 羽。

1.2 样品采集

随机挑选300 日龄的茶花鸡293 羽，翅下静脉采血，保存于-20 ℃冰箱。随机挑选高、低产蛋组试验鸡各10 羽，采集繁殖相关组织(下丘脑、垂体和卵巢)，液氮快速冷冻，保存于-80 ℃。

1.3 DNA 和RNA 提取及cDNA 合成

使用天根生化科技有限公司的抗凝鸡血DNA提取试剂盒(货号：DP304) 提取血液DNA；使用TakaRa 工程有限公司的RNA 提取试剂盒提取下丘脑、垂体和卵巢等组织的RNA (货号：9767)，使用该公司的cDNA 反转录试剂盒(货号：RR-047A)合成cDNA 模板。具体步骤按照说明书进行操作。

1.4 引物设计及合成

使用软件Oligo 7，以GenBank 公布的鸡GDF9基因序列(登录号：NC_006100)对该基因第2 外显子的设计引物F1/R1，产物长度770 bp，F1：TCCCACTTCTTCCTTTACG；R1：CGCTCAGAGGGCTGTATT。参考GenBank 中鸡的mRNA 序列(登录号：NM_206 988.2)，设计GDF9基因的qPCR 引物F2/R2，产物长度318 bp，F2：TCGACTTTTCACCCCGTGTT；R2：GGCCGCAGAAAAGAAGTCAC；内参基因β-actin的引物F3/R3，产物长度225 bp，F3：GTGTGATGGTTGGTATGGGC；R3：CTCTGTTGGCTTTGGGGTTC。

1.5 SNP 检测

采用TaKaRa 的标准2×TaqPCR Mix 体系(25 μL)，检测茶花鸡GDF9基因第2 外显子的SNP位点。具体的反应体系：2×TaqPCR Mix 15 μL，DNA 模板0.8 μL，F1/R1 各0.3 μL，ddH2O 8.6 μL。运行程序：95 ℃ (5 min)预变性；94 ℃ (30 s)变性，退火温度55 ℃ (30 s)，72 ℃ (45 s)延伸，35 个循环；72 ℃后延伸(5 min)。PCR 产物经电泳检测，合格后送至昆明擎科生物有限公司测序。使用SeqMan 软件比对GDF9基因的序列与参考序列，检测SNP 位点；PopGen 32 软件计算群体遗传参数，且多态信息含量(PIC)＜0.25 表示低度多态，0.25＜PIC＜0.5 表示中度多态，PIC＞0.5表示高度多态；SHEsis 软件确定各SNPs 位点之间是否存在连锁不平衡；采用最小二乘法分析多态性位点与产蛋性状的关系。

1.6 qPCR 表达分析

采用TaKaRa 的SYBR®Premix ExTaqTMⅡ的qPCR 常规体系(20 μL)检测GDF9基因在茶花鸡高、低产蛋组不同组织中的表达情况。具体的反应体系：SYBR®Premix ExTapTMII 10 μL，cDNA 2 μL，F2/R2 各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。运行程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；56 ℃ 30 s；72 ℃30 s，循环40 次，95 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt法[13]计算GDF9基因在各组织的表达情况；采用SPSS 21.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 GDF9 的PCR 扩增结果

引物F1/R1 扩增的GDF9基因长770 bp (图1)。

图1 GDF9 基因的PCR 扩增产物Fig.1 PCR amplification product of GDF9 gene

2.2 GDF9 基因序列分析

茶花鸡GDF9基因第2 外显子序列与Gen-Bank 上已公布的GDF9基因序列比对后，在基因组的第1 642、1 652、1 804、2 008 和2 281 位置共发现了5 个SNPs 位点(图2)。其中，g.1652A＞G 位点的A＞G 引发了错义突变，使该处的异亮氨酸突变为了缬氨酸。

图2 GDF9 基因5 个SNPs 的测序峰Fig.2 Sequencing peak map of 5 SNPs of GDF9 gene

2.3 GDF9 基因多态位点遗传学分析

由表1可知：g.1642A＞T、g.1652A＞G、g.1804A＞G、g.2008C＞T 和g.2281T＞C 位点的优势等位基因分别是A、G、G、T 和T，对应的优势基因型分别是AA、GG、GG、TT 和TT；除g.1642A＞T 位点偏离哈温平衡外(P＜0.01)，其他4 个位点均符合哈温平衡(P＞0.05)。g.1652A＞G和g.2281T＞C 是中度多态位点(0.25＜PIC＜0.5)，g.1642A＞T、g.1804A＞G 和g.2008C＞T 是低度多态位点(PIC＜0.25)。遗传多样性分析(表2)显示：5 个SNPs 位点的杂合度均小于纯合度，说明该群体变异程度相对较低。

表1 GDF9 基因SNPs 位点基因型及基因频率Tab.1 Genotype frequency and gene frequency of SNPs in GDF9 gene

表2 GDF9 基因SNPs 的遗传多样性Tab.2 Genetic diversity of SNPs in GDF9 gene

2.4 连锁不平衡分析

5 个SNPs 位点的连锁不平衡分析结果(表3、图3)表明：g.1642A＞T 和g.1804A＞G 位点之间D′值为1.000，r2值为0.003 (＜0.33)，说明这2 个位点之间存在较弱的连锁不平衡效应。其他位点之间的r2值也均小于0.33，均属于较弱的连锁不平衡。

表3 GDF9 基因5 个SNPs 连锁不平衡分析Tab.3 Linkage disequilibrium analysis of 5 SNPs in GDF9 gene

图3 GDF9 基因连锁不平衡分析结果Fig.3 The result of linkage disequilibrium analysis on GDF9 gene

2.5 GDF9 基因SNPs 与产蛋性状的关联分析

由表4 可知：位点g.1642A＞T、g.1804A＞G和g.2008C＞T 不同基因型的产蛋性状差异不显著。位点g.1652A＞G 的AA 型个体开产体质量平均为1 193.83 g，显著高于AG 型(P＜0.05)；AG 型的300 日龄产蛋数平均为91.30 枚，显著高于GG 型(P＜0.05)。位点g.2281T＞C 的CC 型开产日龄平均为171.21 d，显著高于TT 型(P＜0.05)。

表4 GDF9 基因SNPs 不同基因型的产蛋性状差异性分析Tab.4 Analysis of differences in laying traits of different genotypes of GDF9 gene SNPs

2.6 GDF9 基因在组织中的表达分析

由图4 可知：高产蛋组GDF9基因在下丘脑、垂体和卵巢的表达量均高于低产蛋组；在同一产蛋组中，GDF9基因在卵巢中的表达量最高，垂体中等，下丘脑表达最低。

图4 GDF9 基因在组织中的相对表达结果Fig.4 Results of relative expression of GDF9 gene in tissues

3 讨论

母鸡的卵巢发育过程受多因子共同调控，卵巢的发育状态直接影响其产蛋性能，而产蛋性能是评价母鸡繁殖性状的重要指标，是了解其繁殖性状调控机理的基础。卵巢发育过程中，卵母细胞参与细胞间的一系列信号传递过程，如在卵泡形成时期，卵母细胞和体细胞在神经内分泌和旁分泌/自分泌过程中传递信号。对于家禽来说，其繁殖性能也受到神经内分泌轴的调控，下丘脑和垂体释放的激素可调节细胞的分化与增殖[14]。GDF9基因影响鸡的卵巢发育及卵泡形成[15]，本研究在茶花鸡中共检测到GDF9基因的5 个SNPs，其中g.1652A＞G 位点发生了由异亮氨酸突变为缬氨酸的错义突变，这可能会改变蛋白质的结构，甚至改变其功能。其余位点没有氨基酸的改变，属于同义突变现象，但可以通过对mRNA 前体的剪接以及对mRNA 结构稳定性的影响进而影响蛋白质的功能。

基因频率和等位基因的差异会引起生物群体和个体发生遗传变异现象[16]，本研究发现的5 个SNPs 位点经卡方检验有4 个符合哈温平衡定律，表明其遗传并未受到较多的人工选择或者没有发生过遗传漂变，受选择的压力较小。纯合度和杂合度可以反映基因座的纯合比率以及优势等位基因的分布频率[17]，GDF9基因的SNPs 位点遗传参数分析显示：SNPs 位点的纯合度比例均高于杂合度，说明这些位点的突变有较高的遗传均一性。另外，g.1652A＞G 和g.2281T＞C 位点属于中度多态位点，说明具有一定的遗传潜力，遗传变异的可能性大，对于茶花鸡的选育潜力较大。r2和D′是反应连锁不平衡(LD)的2 个重要指标，r2主要反应群体的重组史和突变史，D′主要反应群体的重组史[18-19]，5 个SNPs 位点连锁不平衡分析表明这些位点间均处于弱连锁不平衡，说明在遗传过程中，不同基因座上的等位基因按照随机原则组合的频率较大，优势组合概率较小。

目前对于家畜GDF9基因多态性位点的研究相对较多，尤其是对山羊产仔数的研究，且已被证实在产仔数方面有重要调控作用。ZHAO 等[20]研究内蒙古绒山羊GDF9基因多态性与产仔数的关系发现：非同义突变位点Val397Ile 与产仔数显著相关，而且GG 型比AA 型的产仔数多；FENG等[21]研究发现：GG 型与济宁灰山羊的高产仔数有关；但AA 型与西农莎能奶山羊的高产仔数相关[22]。由此说明，可能是由于品种不同或者其他因素导致相同的突变位点具有不同的生理效应，同一等位基因与繁殖性能的相关性会出现差异，很难判定其真正的作用。因此，WANG 等[23]通过对全世界不同品种山羊GDF9基因的45 个SNPs位点进行归类和分析，发现了15 个影响产仔数的SNPs 位点，认为其中有6 个SNPs 位点与繁殖性能相关，包括3 个非同义突变g.3665C＞T、g.3905A＞C 和g.4135G＞A 以及3 个同义突变g.2006C＞A、g.2159C＞T 和g.3369G＞A。林鹏飞等[24]研究GDF9基因SNPs 与宗地花猪产仔数的关系，发现T1014C 位点DD 型的母猪总产仔数高于DC 型和CC 型，C1009T 位点BB 型的总产仔数、产活仔数高于AB 和AA 型。SUN 等[25]在该基因的第2 个外显子上发现了3 个突变位点539C＞T、562G＞C 和718C＞G 与新西兰兔子产仔数有关。

在禽类研究中，HUANG 等[26]发现：GDF9基因G593A 位点与邵伯鸡的产蛋数和开产体质量显著相关，C896T 位点与开产日龄和开产体质量显著相关。LOU 等[27]发现多个SNPs 与京海黄鸡的开产日龄、300 日龄蛋质量和产蛋数相关，如g.2053G＞A 和g.2420T＞C 位点。在本研究中发现：g.1652A＞G 位点AA 型的开产体质量显著高于AG 型，AG 型的300 日龄产蛋数显著高于GG 型；g.2281T＞C 位点TT 型的开产日龄显著早于CC 型，表明这2 个SNPs 对茶花鸡开产体质量、产蛋数和开产日龄存在影响，对产蛋性状其他指标的影响还有待进一步研究。以上结果揭示了GDF9基因的多态性对地方品种鸡的产蛋性状存在一定的影响。或许在鸡上也存在相同的突变位点具有不同的生理效应的现象，有待于进一步深入研究突变位点的具体功能。

有研究发现：小鼠产后的整个卵泡形成期间，GDF9基因在原始卵泡的卵母细胞中表达很低甚至没有表达，但在卵泡发育的其他阶段有较高表达[28]，包括在排卵期的卵母细胞中也有表达[29]。虽然GDF9基因被认为是卵母细胞特异的细胞因子，但在卵巢外的其他性腺中如雄性动物睾丸中也有表达，甚至在新西兰兔子的心、肝、脾、肺以及肾等组织中也检测到GDF9[25,30-33]。GDF9基因在茶花鸡的高产蛋组3 个组织的表达量均比低产蛋组中高，其中卵巢最高，下丘脑最低，垂体中度表达，这与该基因主要在卵巢发育、卵泡形成过程中发挥功能一致。

4 结论

本研究采用直接测序法检测到云南茶花鸡GDF9基因第2 外显子上有5 个SNPs 位点，其中g.1652A＞G 是错义突变位点且与茶花鸡开产体质量和产蛋数相关，位点g.2281T＞C 与茶花鸡开产日龄相关，GDF9基因在茶花鸡卵巢、垂体和下丘脑组织中均有表达，且在卵巢中表达最高。研究结果可为茶花鸡的进一步选育提供一定的指导。