千家寨野生古茶树对不同海拔的生理响应*

王 菲，王志超，程小毛，梁 涛，黄晓霞**

(1.国家林业与草原局 西南风景园林工程技术研究中心，西南林业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650224；2.云南哀牢山国家级自然保护区镇沅管护局，云南 普洱 666500)

海拔变化包含了温度、湿度、光照、CO2浓度和气压等诸多环境因子的变化，这些变化对植物的生长发育有很大的影响，而植物能够通过形态和生理生化等可塑性变化对复杂多变的环境做出积极响应，从而保证自身的正常生长[1]。在植物生长过程中，叶片的光合色素涉及光能的吸收、能量传递和转化，能客观反映其光能的利用，也是作为判断植物光合生理能力、反映环境胁迫状况的重要指标[2-3]。非结构性碳水化合物(NSC)是植物生命代谢必不可少的能源物质，植物组织中NSC 含量(主要是可溶性糖和淀粉)的变化在很大程度上也影响着植株的生长及对环境的响应[4]。而游离脯氨酸作为植物体内有效的非酶类抗氧化物质，其含量的高低对消除或减轻膜脂过氧化和保持细胞膜系统的完整性具有重要作用[5]。相关研究表明：植物体内游离脯氨酸含量随着海拔的升高而显著升高，而叶绿素含量和可溶性糖含量呈下降趋势[6-8]。低温和强辐射等可以诱导植物体内ASA 和GSH 等低分子量抗氧化物质的生成并增强SOD、APX 和POD 等抗氧化酶的活性，用以抵御和清除活性氧，减轻膜脂过氧化，从而避免植物细胞受到伤害[9]。另外，随着海拔的上升，蒙古栎幼树的叶片质量和叶片生物量明显减少，说明海拔升高不利于植物光合收益的最大化[10]，这也表明植物会通过改变生物量和生物量的分配使其所受到的资源限制最小化，以此来适应不同的环境。这种针对不同的环境条件对光合产物的再分配，对植物适应不同生态环境而言具有非常重要的生态学意义。因此，研究植物的生长和生理生化特性对海拔梯度的响应规律，有助于了解环境变化对植物物种及植被分布的影响。

云南高海拔低纬度的立体气候条件、错综复杂的地形地貌，孕育和保留了全球最集中、最丰富的野生古茶树资源。野生古茶树资源不仅是云南茶树原产地的活化石和见证、国家珍贵财富、人类重要的自然遗产，也是研究茶树起源、演化和品种创新的重要材料。目前已有较多研究关注于野生古茶树的生化成分、群落结构、种群分布格局以及遗传多样性等[11-14]方面，而对于野生古茶树对环境因子的生理生态适应性研究却鲜有报道。因此，本研究以云南省镇沅县千家寨自然保护区内野生古茶树群落为研究对象，通过测定不同海拔野生古茶树群落的生理生化指标，比较其随海拔变化的规律和差异，不仅可以更好地理解野生古茶树对垂直梯度带来的环境差异的响应方式和适应策略，也可以为野生古茶树资源的科学保护及开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 研究区域与野外取样

千家寨(N24°17′，E101°14′)位于云南省普洱市镇沅县哀牢山国家级自然保护区的核心区域。该区域年平均气温为10～12 ℃，降水量1 500 mm以上，无霜期4—10 月，属于中亚热带北缘气候区，其植被呈现出南亚热带常绿阔叶林的山地垂直带植被类型[12]。野生古茶树群落是分布于云南省千家寨自然保护区内的优势树种，其古茶树群落面积和保存完整度均处于世界首位，且许多野生古茶树的树龄约为1 000 年(均为政府挂牌树)，主要分布于海拔2 000～2 500 m[14]。相关文献表明：千家寨野生古茶树为大理茶种(Camellia taliensis)，属于山茶属茶组，是栽培茶树C.sinensis的野生近缘种[13-16]。

本研究根据千家寨自然保护区野生古茶树的自然分布区域，在海拔2 000～2 500 m 范围内的同一坡向上，每间隔150 m 的垂直梯度设置1 个试验样地，共设4 个海拔梯度试验样地：2 050、2 200、2 350 和2 500 m。选择晴朗天气的早上，在每个海拔样地内，相同水平距离间隔随机选取5 个采样点，每个采样点内随机选取1 株生长大小基本一致、无病虫害的挂牌树进行取样。每棵野生古茶树均在树冠中部的周围(东南西北4 个方向)采摘当年生枝上的成熟功能叶，每个海拔5 份样品。将采集好的样品用液氮冷冻，并记录采样地的相关详细信息(表1)，于2019 年4 月底完成野外取样。取样结束后将样品带回实验室进行生理指标的测定，每项指标重复测定5 次。

表1 不同海拔样地概况Tab.1 General situation of land samples at different altitudes

1.2 生理指标测定

游离脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮法[17]；叶绿素含量测定参照苏正淑等[18]的方法，称取0.1 g 野生古茶树叶片，加入10 mL 二甲基甲酰胺避光浸提48 h，分别测定664.5 和647 nm 处吸光值，最后计算叶绿素a 和叶绿素b 含量；类胡萝卜素含量参照黄健等[19]的方法进行测定，称取0.05 g 野生古茶树叶片，加入10 mL 丙酮—乙醇(等体积比) 混合液避光浸提48 h，测定435 nm处吸光值，最后计算类胡萝卜素含量；葡萄糖和淀粉含量的测定采用酶解法[20]，先利用低浓度高氯酸在低温条件下从植物叶片分离可溶性多糖和淀粉，再通过酶解反应将可溶性多糖和淀粉水解为葡萄糖，然后使用葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖含量，推算野生古茶树叶片中糖分和淀粉的含量，最后计算非结构性碳水化合物NSC 含量(葡萄糖、淀粉含量之和)；采用考马斯亮蓝染色法[21]测定可溶性蛋白含量；采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法[22]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；过氧化物酶(POD)活性参照THOMASHOW 等[23]的方法进行测定；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性参照KNRZER 等[24]的方法进行测定；过氧化氢酶(CAT)活性参照李合生[25]的方法进行测定。

1.3 数据分析

数据采用Excel 进行计算和统计，利用SPSS 22.0 和Origin 9.0 软件进行数据分析和图表的绘制，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行不同海拔组间各性状的差异分析，所有数据和平均值的偏离程度均用标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同海拔对野生古茶树叶片游离脯氨酸的影响

从图1 可知：野生古茶树叶片游离脯氨酸含量受到海拔的显著影响(P＜0.05)。游离脯氨酸含量随海拔的增加总体上呈现下降的趋势，其值在低海拔 点2 050 m 处最大 (161.25 μg/g)；而在2 200 m (101.85 μg/g)和2 500 m (93.75 μg/g)显著低于其他海拔，在这2 个海拔间无统计学差异(P＞0.05)，但相对于最低海拔2 050 m，其值分别下降36.84%和41.86%。

图1 不同海拔梯度野生古茶树叶片游离脯氨酸含量(鲜质量，FW)Fig.1 The proline content (fresh weight,FW) in C.talinensis leaves at different altitudes

2.2 不同海拔对野生古茶树叶片光合色素的影响

从表2 可见：不同海拔野生古茶树光合色素含量的变化差异显著(P＜0.05)。随海拔升高，叶绿素a 含量和叶绿素a/叶绿素b 比值先增后降，而总叶绿素和类胡萝卜素含量呈现先增后降再增的变化趋势，但均在2 200 m 达到最大值，其值分别是最低海拔(2 050 m)的158.47%、149.86%、133.25%和120.85%。此外，叶绿素b 含量随海拔高度的上升呈现增—降—增的变化趋势，在2 500 m 处增至最大(1 131.20 μg/g)，但与2 200 m比较无显著差异(P＞0.05)；在海拔2 050 m，类胡萝卜素/总叶绿素的比值显著高于其他海拔。

表2 不同海拔梯度野生古茶树叶片光合色素含量(FW) (mean±SE，n=5)Tab.2 The pigment content in C.talinensis leaves at different altitudes

2.3 不同海拔对野生古茶树叶片可溶性物质的影响

从表3 可见：随海拔的升高，野生古茶树叶片中葡萄糖、淀粉、非结构性碳水化合物及可溶性蛋白的含量先增加后下降，且在2 200 m 处显著高于其他海拔(P＜0.05)；可溶性蛋白含量在2 050 m 处最小(3.70 μg/g)，而葡萄糖、淀粉和非结构性碳水化合物的含量却在2 500 m 处降至最低，其值与2 050 m 比较分别下降50.80%、39.18%和47.00%。

表3 不同海拔梯度野生古茶树叶片内可溶性物质含量 (FW) (mean±SE，n=5)Tab.3 The embedded substance content (FW) in C.talinensis leaves at different altitudes

2.4 不同海拔对野生古茶树叶片抗氧化酶活性的影响

从图2 可知：野生古茶树叶片的抗氧化酶活性受到海拔的显著影响。过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化氢酶(APX) 活性随海拔的增加呈显著上升趋势，在2 500 m 均增至最大值[1 031.95 和1 848.21 μmol/(min·g)]，且是最低海拔(2050 m)的2.48 和2.82 倍；而超氧化物歧化酶(SOD) 活性在2 500 m 处显著低于其他海拔，但在其他3 个海拔间并无显著差异。此外，过氧化氢酶(CAT) 活性在2 200 m 处于最大水平[100.89 μmol/(min·g)]，而在低海拔 [2 050 m，55.84 μmol/(min·g)]及高海拔[2 500 m，45.21 μmol/(min·g)]均显著低于其他海拔，且在这2 个海拔间差异不显著。

图2 不同海拔梯度野生古茶树叶片抗氧化酶活性(FW)Fig.2 The activities (FW) of antioxidant enzymes in C.talinensis leaves at different altitudes

3 讨论

海拔是一个综合性的环境因素，高海拔地区的气候条件恶劣，低温、干旱、低气压和强辐射等不利因素都限制着植物的生长发育，从而促使植物调整内在的生理生化特性及外在的形态结构等来应对逐渐恶劣的环境。吴栋栋等[26]和周党卫等[27]的研究发现：岳桦和珠芽蓼的叶片叶绿素含量随海拔升高而降低，这可能是由于在高海拔环境的光照强度很强，叶绿素含量的下降有利于减少叶片对光的吸收，使植物免受强辐射的损伤；祁建等[28]研究表明：辽东栎的叶绿素含量沿海拔梯度呈现线性升高趋势，这是植物对随海拔升高光照增强的一种适应方式，以利于植物在有限的叶面积下充分进行光合作用；还有研究指出植物叶片叶绿素含量随海拔的变化改变不明显[29]。而本研究结果显示：随海拔升高，野生古茶树叶片叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素含量以及叶绿素a/b 比值均在中间海拔点(2 200 m)达到最大值；说明2 200 m 的生境条件更有利于野生古茶树叶片光合色素的合成，能更好地吸收转换和利用光能。此外，类胡萝卜素除了对光线的吸收传递外，还可以起着光保护的机制，尤其是避免植物光合器官遭受强光的伤害，因此类胡萝卜素的含量在2 200 m 也处于最大。不同海拔野生古茶树叶片叶绿素与类胡萝卜素含量的变化可能与其光照环境相关，2 200 m 处的伴生植物相对较少，林内空间较其他海拔点空旷，其光照更加充足，因此其叶片有着更高的光合色素含量。樊莹等[10]的研究也表明：在光照充分时，低海拔地区植物合成的有机物含量会高于高海拔地区，这可能与海拔梯度带来的温度、降水和土壤差异对植物叶片叶绿素含量的影响有关。而随着海拔升高至2 500 m，野生古茶树叶片中的总叶绿素含量较海拔2 200 m 显著降低，然而其中叶绿素b 的比例却显著上升。叶绿素含量的降低有利于植物有效抵御严寒和吸收紫外辐射，也有助于植物减少光能的吸收以防止因光能过剩而发生光破坏现象。此外，由于叶绿素b 的最大吸收在短波蓝光区(460 nm)，因此野生古茶树叶片中叶绿素b 含量在海拔2 500 m 处显著增高，使得叶绿素a/b比值降低。叶绿素a/b 比值变小反映了植物对外界短波光吸收量增多，这是植物对高原环境富含短波光的适应表现[30]。同时，类胡萝卜素含量增加和类胡萝卜素/叶绿素比值升高可以促进非光化学猝灭耗散过剩光能起到光破坏防御的功能，这也是植物应对高海拔环境的一种适应机制。

有研究表明：林木的可溶性糖和淀粉含量随海拔的升高呈现先升高后降低的趋势[31]。这一观点在本研究中得到了很好的验证。野生古茶树叶片中葡萄糖、淀粉、非结构性碳水化合物及可溶性蛋白含量在2 200 m 处均显著高于其他海拔点，说明在2 200 m 处野生古茶树能累积更多的同化产物，以糖分和淀粉的形式储存于叶片中。此外，野生古茶树叶片叶绿素和类胡萝卜素含量在2 200 m 处达到最大值，这也说明2 200 m 处的环境条件能更好地促进野生古茶树的光合作用，因为当光合速率较高时，植株碳水化合物供应充足，多余的碳水化合物常常以非结构性碳水化合物形式在叶片中(或其他器官)积累，充分的养分供应和水分供应有利于可溶性糖和蛋白质的合成。不过植物碳水化合物代谢对高海拔低温、干旱等逆境条件亦可表现为植株可溶性碳水化合物含量的提高。尹鹏等[32]的研究发现：迎阳报春花叶片可溶性糖和可溶性蛋白质含量随着海拔升高而显著增加，可溶性糖的积累很可能是高海拔植物在抵抗高寒逆境中形成的一种特殊的自我保护生理机制。而章异平等[33]的研究指出：秦岭东段栓皮栎枝条的可溶性糖和淀粉含量均呈现高海拔低于低海拔的趋势。周永斌等[34]的研究显示：长白山白桦木叶片中淀粉含量并未随海拔的升高有明显变化，但枝中的淀粉含量却显著增加。WANG 等[35]针对同一生境下岳桦(Betula ermaniiCham.)、笃斯越橘(Vaccinium uliginosumLinn.)和牛皮杜鹃(Rhododendron aureumGeorgi) 的研究发现：不同物种非结构性碳水化合物含量随海拔的变化趋势存在明显差异。由此可见，植物内含物质的含量变化与其生境条件密切相关，且由于不同树种自身的生理生态特性亦存在较大差异，因此海拔对植物内含组分的影响需综合考虑区域、树种、海拔梯度差和采样组织等诸多因素。

此外，高海拔区域由于强辐射、干旱或低温等不良环境因素的影响，植物容易遭受过氧化伤害，此时植物会同时启动抗氧化酶系统和非酶系统的应对机制，确保其正常生长和代谢。在本研究中，野生古茶树叶片游离脯氨酸含量随海拔升高总体上逐渐降低，表明随着高海拔地区环境逐渐恶劣，野生古茶树抵御不良环境的能力逐渐降低；这和朱军涛等[36]对塔里木沙拐枣的研究结果一致。与此同时，植物可启动体内抗氧化酶系统以应对逆境胁迫带来的伤害，因此高海拔地区的植物叶片通常会有较高的抗氧化酶活性，这一观点在本研究中得到了很好的验证。在高海拔2 500 m 时，抗氧化酶POD 及APX 活性更高，说明这2 种酶在野生古茶树对高海拔的适应中起了主要作用。抗氧化酶活性的升高可以消除或降低植物在高海拔环境胁迫加剧时受到的伤害，使得高山植物的生长发育和光合作用等生理过程得以顺利进行。因此，POD 和APX 活性的升高能够减轻代谢过程中产生的有害物质，进一步减轻膜脂过氧化而对膜系统的损害，避免野生古茶树在高海拔地区由于不良环境给其带来的伤害，进而增强野生古茶树的抗逆性。而在海拔2 500 m处，SOD 活性显著下降，其他3 个海拔无显著差异；CAT 活性在2 200 m 点处于最大值，而在低海拔(2 050 m)及高海拔(2 500 m)均显著低于其他海拔。在本研究结果中，SOD 和CAT 活性并未对海拔梯度表现出敏感性响应，这可能是因为不同植物在面对胁迫环境时，所启动抗氧化酶的种类不尽相同，也可能是因为本研究海拔生境条件的差异性尚不足以引起SOD 和CAT 的响应。

4 结论

随着海拔的升高，野生古茶树天然种群在光合色素及抗氧化酶系统活性方面形成了一定的生态适应以应对逐渐恶劣的环境。叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素含量、叶绿素a/b 比值、葡萄糖、淀粉及可溶性蛋白含量均在(2 200 m)海拔达到最大值，说明海拔2 200 m 更有利于野生古茶树光合生理代谢及光合产物淀粉或糖分的累积。此外，随着海拔上升至2 500 m，葡萄糖和淀粉的含量降至最低水平，游离脯氨酸含量也降至最低，而抗氧化酶POD 和APX 活性增至最高，说明在该海拔点野生古茶树受到的生理胁迫较重，但同时野生古茶树通过启动自身抗氧化酶系统和调动非酶保护系统进行协同作用以降低高海拔低温、干旱和强辐射等不良环境给茶树自身带来的伤害，这是野生古茶树在环境压力下长期适应的结果，也体现了野生古茶树对高海拔环境的一种响应机制。