超高效液相色谱-串联质谱法测定杨梅的6种农药残留

马婧妤， 刘 莉

(金华市农产品质量安全中心， 浙江 金华 321051)

杨梅(Myricarubra)又称圣生梅、树莓，是一种具有较高药用和食用价值的水果[1-4]。全球主产区是中国的南方，占世界杨梅产量的98%，杨梅栽培面积约39万hm2，杨梅的年产量约为100万t，国内杨梅的主要产区在浙江、江苏、江西、安徽、广东、广西和贵州等省。杨梅果树病虫害发生复杂，成熟后期果蝇、白腐病发生较重，影响品质和产量[5-9]。杨梅用药过程中因为缺乏安全用药技术指导，出现乱用和滥用的现象，特别是利益催动下频繁地使用化学农药、植物生长调节剂等促进杨梅的生长和成熟以及防治杨梅病虫害，从而导致杨梅中农药残留的安全风险问题多，风险隐患突出[10-13]。

国内关于甲萘威、克百威、吡虫啉、苯线磷、氯唑磷、嘧菌酯在杨梅中残留检测尚未见报道。为快速检测出杨梅中甲萘威、克百威、吡虫啉、苯线磷、氯唑磷、嘧菌酯的残留量，借鉴标准规定和相关文献的前处理方法，建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用快速检测杨梅中农药残留量的方法，以期为杨梅质量安全检测和农药合理使用提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1 杨梅 杨梅采购于金华市兰溪市马涧镇。

1.1.2 试剂 甲萘威、克百威、吡虫啉、苯线磷、氯唑磷、嘧菌酯(标准品，100 μg/mL，北京振翔科技有限公司)，无水硫酸钠，正己烷均为分析纯；乙腈，甲酸为色谱纯。实验用水(一级水，电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.1.3 仪器 XEVO-TQS#WAC1607超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，CF6RN高速离心机(日本日立公司)，BSA2202S电子天平(德国赛多利斯公司)，T25涡旋振荡器(德国IKA公司)，N-EVAP氮吹仪(Organomation公司)，HY-4调速多用振荡器(金坛盛蓝)。

1.3色谱与质谱条件

1.3.1 色谱 色谱柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：A相，5 mmoL乙酸铵-0.1%甲酸水溶液；B相，甲醇；流速：0.45 mL/min；柱温：40℃；进样量：1 μL；洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%。梯度洗脱条件见表1。

表1液相色谱流动相洗脱条件

1.3.2 质谱 离子化模式：ES(+)；源温度：300℃；DL温度：250℃；加热气：空气10.0 L/min；加热模块温度：600℃；雾化气：氮气3.0 L/min；扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气：氮气10.0 L/min；延迟时间：3 ms；碰撞气：氩气0.15 mL/min。6种农药检测离子对、碰撞能参数见表2。

1.4储备液的配制和线性相关性测试

1.4.1 储备溶液配制 移取甲萘威、克百威、吡虫啉、苯线磷、氯唑磷、嘧菌酯农药标准品(100 μg/mL)各1 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4 μg/mL农药混合标准溶液。吸取2.5 mL上述溶液至10 mL容量瓶，得1 μg/mL农药混合标准溶液，备用。

1.4.2 基质匹配标准曲线 吸取不同体积的1 μg/mL的农药混合标准溶液用1.3.2中的流动相初始溶液进行稀释，分别得到10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL的不同浓度的溶液。浓度从低到高依次进样测定，每一浓度进样3次，以离子色谱峰面积为纵坐标及其相应的溶液浓度为横坐标，以农药标准溶液定量离子峰面积(y)及其对应的含量(x，ng/kg)进行线性回归，绘制标准曲线。

表26种农药定性定量离子参数

1.5样品前处理

1.5.1 试样制备 按GB/T 8855抽取水果样品方法，参考GB 2763—2014标准取杨梅放入食品加工器粉碎，去核，制成待测样。在18℃条件下保存，备用。

1.5.2 提取 准确称取25.00 g(±0.05 g)杨梅试样放入烧杯中，样品尽量在烧杯底部，若粘在壁上，加乙腈时用乙腈进行冲洗。加入50.0 mL乙腈，在匀浆机中高速匀浆2 min后，滤纸过滤，蒸馏水清洗。滤液收集至装有5～7 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，收集滤液40～45 mL。盖上具塞量筒塞子，剧烈震荡1 min，打开盖子，在室温下静置30 min，乙腈相和水相分层。

1.5.3 净化 从100 mL具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈提取液于10 mL试管中，置于50℃水浴锅中氮吹，蒸发至干，加入2.0 mL二氯甲烷+甲醇(9∶1)溶解，盖上铝箔，待净化。将氨基柱用4 mL V二氯甲烷∶V甲醇为9∶1预洗。当溶剂液面达到柱吸附层表面时，立即加入上述待净化液，用4 mL V二氯甲烷∶V甲醇为9∶1过柱后，再用同样条件洗涤氨基柱，合并2次获取的滤液。

将试管置于水浴35℃中，氮吹至近干，加2 mL甲醇，加入2 mL的超纯水，混匀后待其冷却，再用超纯水定容至5.0 mL。在混匀器上混匀后用0.2 μm滤膜过滤，用液质分析。

1.6数据处理

按公式计算超高效液相色谱-串联质谱测定杨梅中6种农药残留量。

(1)

式中：Xi,杨梅样品中待测农残的含量，单位为μg/kg；Ci，从标准工作曲线得到的杨梅样品溶液中待测农残的浓度，单位ng/mL；V，杨梅样品溶液定容体积，单位mL；M，杨梅样品称样质量，单位g。

在杨梅样品中添加2个浓度的6种农药标准溶液，进行添加回收率和精密度试验，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

2结果与分析

2.1杨梅样品前处理优化

2.1.1 提取液 甲萘威、克百威、吡虫啉、苯线磷、氯唑磷、嘧菌酯农药的极性差异较大。乙腈对不同极性的物质均有较好溶解度，可以作为杨梅中农药残留的提取剂。而且，乙腈再提取含有大量色素的样品是可以有效降低色素物质的干扰，大量试验表明乙腈适合多组分同时检测[14]。杨梅溶液呈现酸性，在乙腈中加入1%乙酸，可模拟杨梅果实的酸性环境，避免因为pH变化引起杨梅生物碱性合物的变性。

2.1.2 净化方式 杨梅样品在净化过程中，有2次氮吹，且2次氮吹的温度和最后的氮吹形态均不同。第1次净化氮吹是浓缩样品，将样品中的乙腈吹除，因此氮吹后样品需要尽可能的干燥，减少乙腈对检测结果的干扰。温度设在50℃，温度过高将导致样品中低沸点农药损失。温度低于50℃，氮吹的时间会延长。第2次净化氮吹的目的是除去样品溶液中的二氯甲烷。二氯甲烷的沸点比较低，35℃条件下可以完成氮吹。氮吹温度过高，溶解在二氯甲烷中的农药会随二氯甲烷蒸发，导致回收率偏低。溶液中若有二氯甲烷将导致检测样品分层，浑浊，影响测量的结果。样品溶液经过氮吹净化，体积在1 mL以下，可以认为二氯甲烷完全去除。因为甲醇的沸点远高于二氯甲烷，二氯甲烷优先与甲醇被蒸发。

2.2检测条件优化

2.2.1 色谱条件 采用二元梯度洗脱，流动相A为乙酸铵与甲酸。在正离子模式下，甲酸提供H+，有利于形成[M+H]+，可以提高检测的灵敏度；乙酸铵有助于提高农药在保留时间内的稳定性以及保证峰形对称。通过优化梯度、流速等试验条件，6种农药在10 min内全部出峰(图1)。

图16种农药残留的总离子色谱图

2.2.2 质谱条件 在ES+模式下分别对6种农药标准溶液进行全扫描，确定6种农药分子离子峰[M+H]+，调节离子源电压、锥孔电压和碰撞气出口流量等；以农药分子离子峰作为母离子，进行子离子扫描，当母离子的响应强度是子离子响应强度的25%～30%为最佳调节碰撞能量参数，在质谱图中选择2～3个信号较强的子离子作为定性离子和定量离子，其中丰度最强的子离子作为定量离子，再进行锥孔电压和碰撞能量等质谱参数的优化。质谱参数确定后，取50 ng/mL的混合标准溶液在优化后的色谱条件下逐个进行微调优化，使6种农药的灵敏度、峰形达到最佳。

2.3检测方法评价

2.3.1 方法的标准曲线、线性范围及检出限 由表3可见，6种农药在10～80 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)为0.997 156～0.999 51；以特征定量离子对色谱峰3倍的信噪比(S/N=3)确立方法的检出限为0.4～300 ng/kg，以特征定量离子对色谱峰10倍的信噪比确立方法的定量限为1～1 092 ng/kg，能够满足杨梅中6种农药残留的定量分析要求。

表36种农药标准曲线及相关系数

2.3.2 方法的精密度及回收率 由表4可知，杨梅中6种农药添加样品的回收率为87.23%～97.73%，回收率最低的是嘧菌酯，回收率偏低的原因，可能由于100 ng高浓度样品基质干扰影响。批内的标准偏差为2.01%～6.24%。

2.4基质效应

在农药残留检测时，当样品基质比较复杂，样品集中可能会对检测结果造成干扰，导致目标物准确定量变得困难。对样品采用正确的前处理方法可有效降低基质效应对检测结果的影响[15]。试验采用不含检测农药的空白杨梅样品提取液配制系列基质标准溶液校正回收率，并采用内标法定量，尽可能地降低基质效应对结果的影响。

表4杨梅样品中6种农药的回收率和标准偏差 %

3小结

建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定杨梅中6种农药残留检测的方法，方法的检出限和定量限分别为0.4～300 ng/kg和1～1 092 ng/kg，测定6种农药在10～80 ng/mL时线性关系良好(r>0.997156)，平均回收率范围为87.23～97.73%%(n=6)。该方法相比与普通液相色谱法，定性定量准确，检测速度提升，分离时间缩短，方法的灵敏度和分离度以及重现性较好，稳定性高，满足杨梅中农药残留分析的检测要求，同时溶剂用量大为减少，分析成本降低，检测效率得到提升。