水杨酸对秦艽愈伤组织总酚?总黄酮含量及抗氧化酶活性的影响

雷瑞祥 杨冰月 胡本祥 高静 魏艳妮 曹福麟 罗露 李洁 张岗 刘清 彭亮

摘要 [目的]研究添加不同濃度的水杨酸（SA）对秦艽愈伤组织生长量、总黄酮、总酚含量及抗氧化酶活性的影响。[方法]以秦艽种子为原材料诱导出秦艽愈伤组织，在秦艽愈伤组织的继代培养中加入0、10、50、100、150、200 μmol/L的SA，暗培养25 d后，测定秦艽愈伤组织的生长量、抗氧化酶活性和总黄酮、总酚含量。[结果]与对照组相比，当SA浓度为150 μmol/L时秦艽愈伤组织鲜重达到最大值，SA浓度为100 μmol/L时秦艽愈伤组织干重达到最大值，分别为2.863 5、0.201 7 g，显著高于对照组的鲜重和干重（P<0.05）。秦艽愈伤组织SOD活性在SA浓度为150 μmol/L时达到最大值，为183.95 U/g，是对照组的2.44倍;CAT活性在SA浓度为200 μmol/L时达到最大值，为22.44 U/mg，是对照组的2.56倍;当SA浓度为200 μmol/L时，POD活性虽有所上升，但仍然显著低于对照组（P<0.05），为61.16 U/mg，是对照组的0.40倍。SA浓度为100 μmol/L时，秦艽愈伤组织总黄酮含量达到最大值，为0.77 mg/g，是对照组的1.35倍;SA浓度为50 μmol/L时，总酚含量达到最大值，为0.98 mg/g，是对照组的1.31倍。[结论]一定浓度的SA处理下，有利于秦艽愈伤组织的生长和干物质的积累;适当浓度的SA对秦艽愈伤组织SOD、CAT活性有促进作用，而添加SA会对POD活性有抑制作用;当添加SA浓度为100、50 μmol/L时，分别有利于秦艽愈伤组织中总黄酮、总酚含量的积累。

关键词 秦艽;愈伤组织;水杨酸;总酚;总黄酮;抗氧化酶活性

中图分类号 R284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）02-0165-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.045

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Salicylic Acid on Total Phenol， Total Flavonoids Content and Antioxidant Enzyme Activities in Callus of Gentiana macrophylla

LEI Ruixiang，YANG Bingyue，HU Benxiang et al

（School of Pharmacy， Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine，Qinling Chinese Herbal Medicine Application Development Engineering Technology Research Center， Xianyang，Shaanxi 712046）

Abstract [Objective]To study the effects of different concentrations of salicylic acid （SA） on callus growth， total flavonoids， total phenolic content and antioxidant enzyme activities of Gentiana macrophylla.[Method]The callus of Gentiana macrophylla was induced by the seeds of Gentiana macrophylla. The SA of 0， 10， 50， 100， 150， 200 μmol/L was added to the subculture of Gentiana macrophylla callus. Growth， antioxidant enzyme activity and total flavonoids， total phenolic content was determined after 25 days of dark culture. [Result]Compared with the control group， when the concentration of SA was 150 μmol/L， the fresh weight of callus reached the maximum. When the concentration of SA was 100 μmol/L， the dry weight of callus reached the maximum， which was 2.863 5 and 0.201 7 g， respectively. Significantly （P < 0.05） higher than the fresh weight and dry weight of the control group. The SOD activity of Gentiana macrophylla callus reached a maximum of 183.95 U/g at a concentration of 150 μmol/L， which was 2.44 times that of the control group. The CAT activity reached a maximum at a concentration of 200 μmol/L， which was 22.44 U/mg. The group was 2.56 times;when the concentration of SA was 200 μmol/L， the activity of POD increased， but it was still significantly lower than that of the control group （P<0.05）， which was 61.16 U/mg， which was 0.40 times of the control group. When the concentration of SA was 100 μmol/L， the total flavonoid content of callus reached the maximum， which was 0.77 mg/g， which was 1.35 times of the control group. When the concentration of SA was 50 μmol/L， the total phenolic content reached the maximum. 0.98 mg/g was 1.31 times that of the control group.[Conclusion]A certain concentration of SA treatment is beneficial to the growth and dry matter accumulation of callus in Gentiana macrophylla. The appropriate concentration of SA can promote the activity of SOD and CAT in callus of Gentiana macrophylla， and the addition of SA can inhibit the activity of POD. When the concentration of SA was 100 and 50 μmol/L， it was beneficial to the accumulation of total flavonoids and total phenols in callus of Gentiana macrophylla.

Key words Gentiana macrophylla;Callus;Salicylic acid;Total phenol;Total flavonoids;Antioxidant enzyme activity

中药材秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）为龙胆科龙胆属植物，既是我国的传统中药材，也是国家重点保护的中药材品种之一，主产于陕西、甘肃、四川、内蒙古等地[1]。秦艽始载于《神农本草经》，列为中品，《神农本草经》曰：“（秦艽）主寒热邪气，寒湿风痹，肢节痛，下水利小便。”[2]性苦平，微寒，归胃、肝、胆经，以根入药，具有祛风除湿、活血舒筋、清热利尿的功效，其药理研究主要集中在治疗风湿痹痛、筋脉拘挛、骨蒸潮热、湿热黄疸等病症[3]。近年来，由于人们对于野生秦艽药材的过度采挖，导致秦艽的野生资源分布大大减少[4]，虽然秦艽的人工种植已有研究报道[5]，但是由于秦艽的种质资源混乱，造成了秦艽的种质退化，药材质量参差不齐，极大地影响了秦艽的产业化发展。植物组织培养技术能以少量的组织材料在短时间内进行大量增殖，且不受季节天气的影响[6]，已经被用于多种药用植物的快速增殖之中，如天山雪莲[7]、南方红豆杉[8]等。

从细胞培养的角度来讲，诱导子是指能促进植物细胞产生目的产物的因子，其中包括生物诱导子和非生物诱导子[9]，利用诱导子来提高植物细胞的次生代谢产物现在已经在甘草[10]、黄芪[11]等中药材中。水杨酸（salicylic acid，SA）作为一种非生物诱导子，在植物次生代谢过程中以特定的生化信号快速地、选择性地诱导特定基因表达，调节植物细胞的次生代谢产物合成[12]，已经被用于黄芩[13]、丹参[14]等药用植物的细胞培养之中。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是植物体内广泛存在的3种抗氧化酶。植物可通过提高其体内抗氧化酶活性从而减轻膜质过氧化程度，进而有效诱导植物防御反应的产生，最终影响次生代谢产物的合成与积累[15]。

该试验以秦艽种子为材料诱导秦艽愈伤组织，添加不同浓度的SA进行处理，探讨SA对秦艽愈伤组织生长、总酚、总黄酮含量及抗氧化酶活性的影响，为秦艽愈伤组织的优良品系培养及次生代谢产物的生产提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。

秦艽种子购于陕西省铜川市王益区药材采购供应站，由陕西中医药大学中药鉴定教研室胡本祥教授鉴定为龙胆科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）的干燥成熟种子。

1.1.2 试剂。

MS 基本培养基（北京康倍斯科技有限公司，批号 B0017K0315008）;二氯苯氧乙酸2，4-D（上海蓝季生物有限公司，批号 B00009）;6-苄氨基腺嘌呤6-BA（上海蓝季生物有限公司，批号B00004）;SA（源叶生物科技有限公司，批号Z22J9Y64166）;芦丁（中国食品药品检定研究院，批号 201508）;没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号 201701）;无水乙醇、次氯酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠，天津市天力化学试剂有限公司;福林酚试剂（上海荔达生物科技有限公司，批号 PRLB09500）;蛋白定量、总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒，批号分别为20190621、20190428、20190508、20190509，均购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器。

生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）;SW-CJ-1FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;GR60DA 型立式自动压力蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）;FA2104型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）;SIM-F140ADL型制冰机（Panasonic）;Centrifuge 5804R型离心机（Eppendorf）;DZKW-D-4型电热恒温不锈钢水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 秦艽无菌苗的培养。

将秦艽种子用水浸泡12 h后放置于无菌操作台，在操作台中用75%乙醇消毒10 s，无菌水清洗3～4次，再放入2%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗5～6次。將消毒好的秦艽种子用无菌滤纸吸干其表面水分，接种于不添加任何激素的MS固体培养基上，于光照强度 2 000 lx、光照条件 12 h/d 的（25±1）℃生化培养箱中培养，待无菌苗长至5～7 cm高时，可以作为诱导秦艽愈伤组织的外植体备用。

1.2.2 秦艽愈伤组织的诱导。

选择长势良好的秦艽无菌苗，在无菌操作台中做以下处理。使用灭菌后的镊子和剪刀将秦艽的叶片剪切成0.5 cm×0.5 cm的形状，接种于MS固体培养基（MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L+30 g/L蔗糖+8 g/L 琼脂）中。将诱导秦艽愈伤组织的组培瓶放置于湿度（65+5）%、温度（25±5）℃的生化培养箱中暗培养25 d，待愈伤组织诱导形成后继代3次，作为该试验的材料，继代用的MS固体培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L+30 g/L 蔗糖+8 g/L琼脂。

1.2.3 SA诱导子诱导秦艽愈伤组织。

定量称取秦艽愈伤组织，接种于含有浓度分别为0、10、50、100、150、200 μmol/L的SA的MS培养基（MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L+30 g/L 蔗糖+8 g/L琼脂）中，每个浓度设置3个重复，于湿度（65+5）%、温度（25±5）℃的生化培养箱中暗培养25 d。

1.2.4 秦艽愈伤组织生长量的测定。

当秦艽愈伤组织生长25 d后从组培瓶中取出，用滤纸吸干表面水分，称其鲜重质量，再放入40 ℃的烘箱中烘至恒重，取出，称其干重。以SA浓度为横坐标、秦艽愈伤组织鲜重和干重为纵坐标，绘制秦艽愈伤组织生长曲线。

1.2.5 抗氧化酶活性的测定。

可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[16]，POD活性测定采用愈创木酚比色法[16]，CAT活性测定采用紫外可见分光光度法[16]，SOD活性测定采用氮蓝四唑光化学还原法[16]，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 總黄酮含量的测定。

1.2.6.1 供试品溶液的制备。将干燥至恒重的秦艽愈伤组织用研钵研成细粉，精密称取0.1 g粉末至50 mL具塞锥形瓶中，加入70%乙醇3 mL，超声40 min，2 000 r/min离心10 min，取上清液至50 mL锥形瓶中，药渣再加入3 mL 70%乙醇超声提取，提取3次，合并3次上清液，放入4 ℃的冰箱里备用。

1.2.6.2 对照品溶液的制备。精准称取芦丁对照品0.010 9 g，置10 mL容量瓶中，加80%乙醇定容至刻度线，制成浓度为1.09 mg/mL 的芦丁对照品，放入4 ℃的冰箱里备用。

1.2.6.3 标准曲线的绘制。用移液枪分别精准吸取0、100、200、300、400、500 μL的芦丁对照品至干燥的离心管中，加入80%乙醇使其初始体积为2.6 mL，随后向试管中加5%的亚硝酸钠试剂0.6 mL，反应6 min，加10%的硝酸铝试剂0.6 mL，反应6 min，最后加入4.2 mL 4%的氢氧化钠溶液，充分混匀放置20 min后在波长为510 nm的紫外分光光度计下测定吸光度。以芦丁含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制芦丁的标准曲线，其线性回归方程为Y=1.498 6X-0.000 5（R2=0.999 9）。

1.2.6.4 样品中总黄酮含量的测定。取待测供试品溶液各2.6 mL于10 mL离心管中，按照“1.2.6.3”下对芦丁对照品的检测方法，测定各供试品的吸光度，分别计算出各供试品中的总黄酮含量。

1.2.7 总酚含量的测定

1.2.7.1 供试品溶液的制备。制备方法同“1.2.6.1”方法。

1.2.7.2 对照品溶液的制备。精准量取0.012 4 g的没食子酸对照品至10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线处，制成浓度为1.240 mg/mL的没食子酸对照品，保存在4 ℃下的冰箱里备用，将浓度稀释为0.124 0 mg/mL时使用。

1.2.7.3 标准曲线的绘制。采用Folin-Ciocalteu试剂法，配制系列质量浓度的没食子酸对照品溶液。用移液枪分别精准量取没食子酸对照品溶液0、100、200、300、400、500 μL加入干燥的10 mL离心管中，加蒸馏水至初始体积为4.0 mL，随后向离心管中依次加入1 mL 1.0 mg/mL的FC和3 mL 7.5%的碳酸钠溶液，在40 ℃的水浴锅中保温1 h，取出放凉后在紫外波长为765 nm下测吸光度。以没食子酸含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制没食子酸的标准曲线，其线性回归方程为Y=14.242X+0.014（R2=0.999）。

1.2.7.4 样品中总酚含量的测定。测定前，将配制好的样品溶液浓度稀释为1.0 mg/mL，精准量取4.0 mL的样品溶液，置于干燥的离心管中，按“1.2.7.3”方法处理后测定吸光度，将所测吸光度代入标准曲线中，计算总酚含量。

1.3 数据分析及处理

使用Excel 2010对数据进行回归分析，SPSS 19.0进行数据处理，Original 8.0进行绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的SA对秦艽愈伤组织生长的影响

由表1可知，秦艽愈伤组织接种到含不同浓度SA的MS培养基上暗培养25 d后，其鲜重、干重均有不同程度的增加。与对照组相比，当SA浓度为150 μmol/L时秦艽愈伤组织鲜重达到最大值，SA浓度为100 μmol/L时秦艽愈伤组织干重达到最大值，分别为2.863 5、0.201 7 g，显著高于对照组的鲜重和干重（P<0.05）。说明当添加SA浓度为150 μmol/L时，有促进秦艽愈伤组织生长的作用，而当添加SA浓度为100 μmol/L时，更有利于秦艽愈伤组织干物质含量的积累。

2.2 不同浓度的SA对秦艽愈伤组织SOD活性的影响

从图1可以看出，与对照组相比，随着SA浓度的增加，秦艽愈伤组织SOD活性总体呈现先增大后减小再增大再减少的趋势。SOD活性在SA浓度为150 μmol/L时达到最大值（183.95 U/g），是对照组的2.44倍。随着SA浓度的逐渐增大，SOD活性呈现逐渐降低的现象，当SA浓度为100和200 μmol/L时，SOD活性显著低于对照（P<0.05），这说明在SA浓度为150 μmol/L时可以促进秦艽愈伤组织SOD活性，而过高的SA浓度（200 μmol/L）则会抑制SOD活性。

2.3 不同浓度的SA对秦艽愈伤组织CAT活性的影响

从图2可以看出，与对照组相比，随着SA浓度的增大，秦艽愈伤组织CAT活性基本呈现先减小后增大的趋势。CAT活性在SA浓度为200 μmol/L时达到最大值，为22.44 U/mg，是对照组的2.56倍;当SA浓度为10 μmol/L时，CAT活性达到最小值（4.65 U/mg），显著低于对照组（P<0.05）;说明低浓度的SA抑制CAT活性，而高浓度的SA促进CAT活性。

2.4 不同浓度的SA对秦艽愈伤组织POD活性的影响

从图3可以看出，与对照组相比，随着SA浓度的增大，秦艽愈伤组织POD活性呈现先减小后增大的趋势，但均低于对照。POD活性在SA浓度为100 μmol/L时达到最低值，为20.54 U/mg，仅为对照组的0.14倍。当SA浓度为200 μmol/L时，POD活性虽有所上升，但仍然显著低于对照组（P<0.05），说明添加不同浓度的SA对秦艽愈伤组织POD活性有抑制作用。

2.5 不同浓度的SA对秦艽愈伤组织总黄酮含量的影响

从图4可以看出，与对照组相比，随着SA浓度的增大，秦艽愈伤组织总黄酮含量呈现先增大后减少的趋勢。SA浓度为10、50、100、150 μmol/L时，总黄酮含量显著高于对照组含量（P<0.05），其中SA浓度为100 μmol/L时，总黄酮含量达到最大值，为0.77 mg/g，是对照组的1.35倍。SA浓度为200 μmol/L时，总黄酮含量为最小值，是0.53 mg/g，显著低于对照组（P<0.05）。说明低浓度的SA可以促进秦艽愈伤组织总黄酮含量的积累，而高浓度的SA则会抑制其总黄酮含量的积累。

2.6 不同浓度的SA对秦艽愈伤组织总酚含量的影响

从图5可以看出，与对照组相比，随着SA浓度的增大，秦艽愈伤组织总酚含量呈现先增大后减少的趋势。SA浓度为10、50、100、150、200 μmol/L时，总酚含量显著高于对照组含量（P<0.05），其中SA浓度为50 μmol/L时，总酚含量达到最大值，为0.98 mg/g，是对照组的1.31倍。SA浓度为10、150 μmol/L时，两组总酚含量之间无显著性差异（P>0.05），显著低于除对照组外的其他试验组（P<0.05），而又显著高于对照组（P<0.05）。

3 讨论与结论

愈伤组织具有结构松散、容易分离、成本低等特点，可以节约土地资源、降低生产周期，有利于实现植物次生代谢产物的工业化生产[17]。近年来，应用植物组织培养技术生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物发展十分迅速，已经在甘草[18]、雷公藤[19]、杜仲[20]等药用植物研究方面取得了良好的成果。水杨酸（SA）作为一种非生物诱导子可诱导多种植物次生代谢物合成积累量的增加[21]，一定浓度的水杨酸诱导子可以通过改变植物次生代谢物合成途径上关键酶的活性来提高次生代谢物的合成积累量[22]，这一点已经在远志[12]、黄芩[13]等植物上得以体现。

该试验以秦艽愈伤组织为原材料，考察了不同浓度的SA对秦艽愈伤组织生长、抗氧化酶活性、总黄酮和总酚含量的影响。结果表明，添加一定浓度的SA对秦艽愈伤组织的生长具有促进作用，其中SA浓度为150、100 μmol/L时，秦艽愈伤组织鲜重和干重分别达到最大值，分别为2.863 5、0.201 7 g，与对照组相比具有显著性差异（P<0.05），说明适当浓度的SA促进秦艽愈伤组织的生长，而当SA达到一定浓度时，则会对秦艽愈伤组织的生长产生抑制作用，这一点与李洁等[12]的研究结果基本一致。

SOD、POD、CAT被称为植物体内的抗氧化保护酶，主要作用是清除细胞内的活性氧（ROS）[23]，SOD的主要功能是清除植物体内的超氧阴离子，降低氧自由基对细胞膜的系统伤害[16];POD和CAT可以及时清除细胞内过量H2O2，使H2O2转化为H2O，对维持细胞活性氧的代谢平衡起着关键作用[13]。该试验研究结果表明，随着SA浓度的增大，SOD活性呈现先增大后减小再增大再减少的趋势，总体表现为先增大后减少，这与孟书亦等[13]的研究结果基本一致;CAT活性与对照组相比，呈现先减少后增大的趋势;POD活性与对照组相比，呈现先减少后增大的趋势，但均低于对照，这一点与孟书亦等[13]的研究结果也是一致的。当SA添加量为150 μmol/L时，SOD活性达到最大值，清除植物体内有毒害作用的超氧阴离子;随着SA浓度增大到200 μmol/L时，SOD活性降低，CAT和POD活性增加，两者起着协同作用清除植物体内多余的H2O2，从而减少其对植物细胞的伤害。

不同浓度的SA对秦艽愈伤组织中总黄酮、总酚含量的影响具有显著性差异（P<0.05），随着SA浓度的增大，与对照组相比，总黄酮、总酚含量呈现先增大后减小的趋势。在SA浓度为100 μmol/L时，总黄酮含量达到最大值，为0.77 mg/g，是对照组的1.35倍;SA浓度为50 μmol/L时，总酚含量达到最大值，为0.98 mg/g，是对照组的1.31倍;说明一定浓度的SA能促进秦艽愈伤组织总黄酮、总酚含量的积累，而当SA浓度过高，则不利于总黄酮、总酚含量的积累。该试验结果表明，当添加SA浓度为100、50 μmol/L时，分别有利于秦艽愈伤组织中总黄酮、总酚含量的积累。

该试验以秦艽愈伤组织为原材料，通过添加不同浓度的SA，考察不同浓度的SA对秦艽愈伤组织生长量、总黄酮、总酚含量及抗氧化酶活性的影响，为以后进一步研究秦艽愈伤组织次生代谢产物积累和调控奠定了基础，也为秦艽愈伤组织优良品系的培育和秦艽愈伤组织规模化的生产提供一定的参考。

参考文献

[1] 张恩迪，郑汉臣.中国濒危野生药用动植物资源的保护[M].上海：第二军医大学出版社，2000：28.

[2] 黄爽.神农本草经[M].影印本.北京：中医古籍出版社，1982：177.

[3] 国家中医药管理局编委会.中华本草：第17卷 [M].上海：上海科学技术出版社，1999：231.

[4] 张西玲，晋玲，刘丽莎.濒危药用植物秦艽的资源利用与保护[J].中药研究与信息，2003，5（9）：27-29.

[5] 武小龙.中药材秦艽丰产栽培技术[J].现代农业科技，2008（16）：59，62.

[6] 路平.淺议植物的组织培养[J].农技服务，2017，34（5）：30.

[7] 丁黛灵，陈芸，魏炯河，等.天山雪莲组织培养体系的优化[J].甘肃农业科技，2019（6）：25-29.

[8] 袁云香.硅对南方红豆杉愈伤组织诱导及增殖培养的影响[J].科学技术与工程，2018，18（35）：121-123.

[9] 王和勇，罗恒，孙敏.诱导子在药用植物细胞培养中的应用[J].中草药，2004，35（8）：附3-附7.

[10] 杨世海，刘晓峰，果德安，等.不同附加物对甘草愈伤组织培养中黄酮类化合物形成的影响[J].中国药学杂志，2006，41（2）：96-99.

[11] 杜研，王康宇，王义，等.真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响[J].吉林农业大学学报，2011，33（3）：293-300.

[12] 李洁，胡本祥，彭亮，等.水杨酸和茉莉酸甲酯对远志愈伤组织生长和相关酶活性及化学成分的影响[J].中草药，2019，50（12）：2976-2982.

[13] 孟书亦，马秀杰，韩梅，等.水杨酸对黄芩愈伤组织抗氧化酶活性及黄芩苷含量的影响[J].分子植物育种，2017，15（10）：4179-4183.

[14] 焦蒙丽.水杨酸和茉莉酸甲酯对丹参培养细胞迷迭香酸生物合成的诱导作用[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.

[15] 安钰，沈应柏，张志翔.伤害胁迫对合作杨叶片膜质过氧化及抗氧化酶活性的影响[J].水土保持研究，2010，17（5）：241-244.

[16] 彭亮，杨冰月，张岗，等.干旱胁迫对远志种子萌发及幼苗生长和生理特性的影响[J].西北植物学报，2018，38（4）：741-749.

[17] 曹福麟，胡本祥，彭亮，等.H2O2对远志愈伤组织中总酚总黄酮含量及相关酶活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（20）：153-159.

[18] 柳福智，杨秀艳.无机盐对甘草愈伤组织生长及总黄酮含量的影响[J].草业学报，2017，26（5）：118-126.

[19] 孙睿，朱留刚，封磊，等.雷公藤愈伤组织的生长特征及内酯醇的积累[J].森林与环境学报，2016，36（3）：306-311.

[20] 张志斌，颜日明，邱晓芳，等.杜仲愈伤组织与悬浮细胞中黄酮和绿原酸积累研究[J].中国中药杂志，2009，34（13）：1636-1639.

[21] CHEN J Y，WEN P F，KONG W F，et al.Effect of salicylic acid on phenylpropanoids and phenylalanine ammonialyase in harvested grape berries[J].Postharvest biology and technology，2006，40（1）：64-72.

[22] 董娟娥，张康健，梁宗锁.植物次生代谢与调控[M].杨凌：西北农林科技大学出版社，2009.

[23] APEL K，HIRT H.Reactive oxygen species：Metabolism，oxidative stress and signal transductionv[J].Annual review of plant biology，2004，55：373-399.